京尼平苷调控Wnt/β-cantenin信号通路抑制胃癌转移的机制研究

王金乐 朱星蓉 夏爱丹 林银凤 陈斌斌 孙宏迪 谢炳寿

胃癌是一种常见的消化系统肿瘤，全球近半数胃癌新发及死亡病例均发生在中国[1]，胃癌复发转移是导致患者死亡的重要因素之一，术后复发率＞50%，其中大部分是远处转移复发[2]。Wnt/β-cantenin信号通路的异常活化是胃癌发生发展的关键，其参与胃癌细胞的周期调控、上皮-间充质转化（epithelia1-mesenchymal transition，EMT）等多个过程，并在一定程度上决定胃癌患者的预后[3-4]，以DKN-01、IWP-2、Rspo3为靶点的靶向药物仍处于实验研究阶段。京尼平苷（geniposide，GEN）是一种环烯醚萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等多种药理活性[5-6]，在口腔鳞癌HSC-3细胞中显示出抗肿瘤作用[7]，还可以通过改变凋亡相关因子Bcl-2及Bax的表达进而促进宫颈癌HeLa细胞的凋亡[8]。GEN在体外和体内均显示出对幽门螺杆菌感染的抑制作用[9]，但国内外关于GEN作用于胃癌的研究报道并不多见。该研究通过体外培养胃癌SGC-7901细胞，探讨GEN对SGC-7901细胞侵袭转移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）细胞：人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。（2）主要试剂：胎牛血清购自美国Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）购自上海凌峰化学试剂公司；乙醇购自上海吉诺试剂公司；RPMI-1640液体培养基购自美国GIBCO公司；NaCl和KC1购自上海生工生物股份有限公司；Na2HPO4和KH2PO4购自国药集团化学试剂有限公司；LiCl购自美国Merck公司；Fibronectin（F8180）购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁生物；4%多聚甲醛购自上海博谷生物科技有限公司；青霉素-链霉素、胰蛋白酶消化液和结晶紫染色液购购自上海碧云天科技有限公司；Matrigel基质胶（354234）购自美国BD公司；反转录试剂盒和q-PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；兔单克隆抗体β-catenin（8480S）、鼠单克隆抗体E-cadherin（14472）、兔单克隆抗体Snail（3879S）、兔单克隆抗体Vimentin（5741）和兔单克隆抗体GAPDH（2118）购自美国CST公司；HRP标记山羊抗兔IgG（A0208）和HRP标记山羊抗小鼠IgG（A0216）购自上海碧云天科技有限公司；HRP化学发光底物购自美国Miliipore公司。（3）主要仪器：电子分析天平购自德国赛多利斯公司；化学发光成像系统购自上海勤翔科学仪器有限公司；细胞计数仪、多功能酶标仪、垂直电泳仪、Western湿转仪购自美国BIO-RAD公司；Transwell小室购自美国corning公司；StepOne Plus实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司；小离心机购自德国Eppendorf公司；二氧化碳孵箱购自美国Thermo公司；倒置光学显微镜购自日本奥林巴斯公司；荧光显微镜购自奥林帕斯（中国）有限公司。

1.2 实验方法 （1）细胞培养：在含10% FBS和1% 青-链霉素的RPMI-1640培养基中培养人胃癌细胞株SGC-7901，培养环境为饱和湿度、37 ℃、95%空气、5% CO2的培养箱。（2）CCK-8法测定GEN对SGC-7901细胞增殖的作用：取SGC-7901细胞接种细胞于96孔板中，每孔1×104个细胞；次日配制含0、50、100、200、400、600、800、1,000、1,200、1,400 μM GEN的RPMI-1640培养基，取100 μL上述培养基加入96孔板细胞中，每组接种3个复孔，置于37℃、5% CO2的孵箱中分别培养24、48 h；然后，将96孔板中的含GEN培养基更换为含10% CCK-8的RPMI-1640培养基，每孔100μL，继续培养2 h，最后测定吸光度。（3） Transwell测定GEN对SGC-7901细胞迁移的作用：分别用含低、中、高剂量GEN的培养基，将浓度为2.0×106个/mL的细胞150μL加入Transwell上室，并在下室加入含纤连蛋白的RPMI-1640培养基，培养24 h，之后取出小室，并拭去上层细胞后，加入甲醇固定15 min，然后加入结晶紫染色30 min，洗去染色液后干燥。（4）Transwell测定GEN对SGC-7901细胞侵袭的作用：取 50μL预冷的基质胶稀释液（基质胶：培养基=1∶2）加入Transwell上室，置于超净台内过夜风干，其余步骤同前。（5）蛋白印迹法测定β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表达：分组处理后，进行蛋白印迹法，其中抗体配比如下，β-catenin（1∶1,000）、E-cadherin（1∶500）、Snail（1∶500）和Vimentin（1∶500）。（6）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表达：分组处理后，采用TRIZOL法提取SGC-7901细胞总RNA，将基因组DNA去除后将RNA逆转录为cDNA，运用SYBR Green 法将得到的cDNA进行qPCR反应。采用2（-△△CT）法计算β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表达水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成：GAPDH，5- GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA -3（forward） and 5- CCAAATTCGTTGTCATACCAG -3（reverse）；E-cadherin，5- CGAGAGCTACACGTTCACGG -3（forward） and 5- GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG -3（reverse）；Vimentin，5- AGTCCACTGAGTACCGGAGAC -3（forward） and 5- CATTTCACGCATCTGGCGTTC -3（reverse）；Snail，5- CAATCGGAAGCCTAACTA -3（forward） and 5- CAGATGAGCATTGGCAGCG -3（reverse）。（7）LiCl和GEN共处理SGC-7901细胞：分别设置空白组、GEN（80μM）组、LiCl（5μM） 与GEN共处理组，应用Transwell实验检测对胃癌细胞迁移和侵袭的作用，采用蛋白印迹法检测蛋白表达，利用q-PCR技术检测mRNA水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEN对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 根据CCK-8实验得到GEN作用24 h对SGC-7901细胞的IC10=（165.14±10.93）μM，见图1A；作用48 h对SGC-7901细胞IC10=（201.00±19.45）μM，见图1B；选取40、80、160μM作为观察GEN抑制SGC-7901细胞侵袭转移的低、中、高剂量。

图1 GEN对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

2.2 GEN对胃癌SGC-7901细胞株迁移和侵袭功能的影响 GEN作用SGC-7901细胞24 h后，对照组和低、中、高剂量组穿过Transwell小室的SGC-7901细胞数分别为550个、431个、280个、145个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2A和 2B。GEN作用胃癌SGC-7901细胞48 h后，各组穿过基质胶和小室膜的SGC-7901细胞数分别为387个、261个、139个、69个，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2A和2C。

图2 GEN抑制胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭

2.3 GEN对胃癌SGC-7901细胞EMT的作用 结果显示，低、中、高剂量组的E-cadherin蛋白及mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。GEN低、中、高剂量组的Vimentin蛋白及mRNA表达明显受抑制，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3～4。

2.4 GEN抑制胃癌SGC-7901细胞Wnt/β-cantenin信号通路 与对照组比较，GEN低、中、高剂量组β-cantenin和Snail的蛋白及mRNA表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3～4。

图3 GEN对胃癌SGC-7901细胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表达的作用

2.5 GEN通过Wnt/β-cantenin信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭 给予Wnt激活剂LiCl后再给予GEN（80μM），与干预正常SGC-7901胃癌细胞比较，发现GEN抑制其迁移和侵袭的能力减弱（P＜0.01）。与干预正常SGC-7901胃癌细胞组比较，LiCl与GEN联合处理组细胞的E-cadherin的蛋白及mRNA表达量明显下调（P＜0.01）；β-catenin、Snail和Vimentin的蛋白及mRNA表达量明显升高（P＜0.01），见图5～7。

图4 GEN对胃癌SGC-7901细胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表达的作用

图5 GEN与LiCl联合处理对胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响

图6 GEN与LiCl联合处理对SGC-7901细胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表达的影响

图7 GEN与LiCl联合处理对SGC-7901细胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表达的影响

3 讨论

胃癌转移是导致患者死亡的主要原因，癌细胞的侵袭、转移是一个复杂的过程，而远处转移的第一步需要完成上皮细胞-间充质-转换（EMT），即上皮细胞失去胞间的连接性，获得了向远处迁移和侵袭能力。EMT过程中最主要的表现为钙黏着蛋白由上皮型（E-cadherin）向神经元型转化，会出现E-钙黏着蛋白的表达量减少，而角蛋白骨架则逐渐向波形蛋白（Vimentin）转化，导致波形蛋白的表达量增多[10]。Snail是诱导EMT过程中最重要的转录因子之一，能通过多种途径调节EMT过程[11-12]。Wnt/β-catenin信号通路在胃癌的发生发展中起着重要作用，β-catenin是该通路的关键蛋白，有研究显示β-catenin能够激活Snail蛋白的合成，进而影响肿瘤的迁移和侵袭[13]。

京尼平苷是一种环烯醚萜类化合物，是中药栀子和杜仲的主要有效成分，具有护肝利胆、镇痛降糖、增强学习能力等作用，以栀子和杜仲为主药的方剂已被证实具有良好抗肿瘤作用[14-15]。阴虚痰凝是胃癌发生的主要病机，而杜仲的功效以补肾滋阴为主，栀子以清利痰湿为主，与胃癌的病机相对应[16-17]。基础研究，显示，京尼平苷能够抑制人口腔鳞状细胞癌细胞[7]、宫颈癌HeLa细胞[8]以及胃癌MKN45细胞[18]的增殖，但其对于胃癌转移的作用，还未见相关报道。

该研究通过CCK8法测定GEN对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，确定其IC10值，为排除GEN对胃癌细胞增殖的影响，确定40、80、160μM为GEN测定迁移和侵袭的实验剂量，结果显示GEN在体外能够抑制胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭。GEN处理细胞后，通过Westernblot和q-PCR发现GEN能够促进E-cadherin蛋白及mRNA表达，抑制Vimentin蛋白及mRNA表达，表明GEN是通过抑制EMT过程抑制胃癌细胞迁移和侵袭，进一步探索发现GEN能够抑制EMT上游关键转录因子Snail和Wnt/β-catenin通路关键蛋白β-catenin的表达，而β-catenin能够促进Snail的表达。因此，笔者认为GEN可能是通过调控Wnt/β-catenin通路抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭。通过用Wnt激活剂LiCl与GEN共处理胃癌细胞，发现能降低GEN抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的作用，并拮抗GEN诱导的β-catenin和Snail表达下降能力，并导致E-cadherin表达下调，Vimentin表达升高。

综上所述，GEN能够在体外抑制人胃癌SGC-7901细胞的迁移与侵袭，其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路抑制EMT过程而实现的。但该研究仅通过体外细胞实验证实GEN抑制胃癌细胞转移的效果与机制，其在体外抑制胃癌转移的效果以及如何抑制Wnt/β-catenin通路，均有待进一步深入探究，以期为临床治疗胃癌复发转移提供新思路。