鹿红方调节PI3K/AKT通路抑制心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡机制研究

赵丹丹，瞿惠燕，杨涛，张晓青，郭佳莹，周华

上海中医药大学附属曙光医院心病研究所，上海 201203

心力衰竭是大多数心血管疾病的终末阶段，具有较高的发病率和病死率，且预后较差。左心功能与结构改变是心力衰竭发生发展的预测指标，与心肌细胞的进行性丢失密切相关。细胞凋亡是心肌细胞进行性丢失的主要原因。有研究表明，细胞凋亡参与心脏由代偿性肥大到失代偿性重构的全过程。因此，抑制或消除凋亡级联反应可能有利于阻止不良重构和心力衰竭的进展。PI3K/AKT通路是机体具有多重效应的信号通路，并可通过调节Bcl-2家族成员活性与表达调控细胞凋亡，参与心力衰竭的病理生理过程。

研究表明，中医药辨证论治心力衰竭具有多靶点、多途径调节的作用。鹿红方是周华教授治疗心力衰竭的有效经验方，具有补肾强心、活血通络功效，已在临床应用数十年。课题组前期研究发现，鹿红方可以改善心力衰竭患者心功能与临床症状，抑制心力衰竭动物模型心肌细胞焦亡与炎症反应，延缓心力衰竭进程。基于此，本研究通过结扎冠状动脉制备心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，观察鹿红方能否通过调控PI3K/AKT通路抑制心肌细胞凋亡，为鹿红方的临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，7～8周龄，购于浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（浙）2019-0001。大鼠饲养于上海中医药大学动物实验中心，温度（22±2）℃、相对湿度55%～75%环境，12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。本实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会审批（PZSHUTCM190322020）。

1.2 药物及制备

鹿红方（鹿角片15 g，红花9 g，山萸肉15 g，补骨脂20 g，淫羊藿30 g，女贞子30 g，沉香6 g），饮片购自上海中医药大学附属曙光医院。按比例称取饮片，加10倍量水浸泡45 min，煎煮85 min，过滤，收集滤液，药渣再加水煎煮45 min，过滤，合并2次滤液，减压浓缩，喷雾干燥，制成干浸膏备用（每克浸膏含原药材4.08 g），使用前加蒸馏水配制成浓度为0.276 g/mL。培哚普利片，8 mg/片，施维雅（天津）制药有限公司，批号190527-02，使用前加适量蒸馏水配制成浓度为0.072 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器

TUNEL试剂盒（武汉赛维尔，货号G1501），B型利钠肽（BNP）试剂盒（上海朗顿生物，货号BPE30445），异氟烷（上海玉研，货号S10010533），BCA蛋白定量试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、SDS-PAGE配制试剂盒、BSA（上海碧云天生物，货号分别为P0012、P1045、P0013C、P0012AC、ST023-200g），PI3K 抗体（美国CST，货号4249），Akt抗体（美国CST，货号4691），p-Akt抗体（美国CST，货号4060），Bcl-2 抗体（英国Abcam，货号ab196495），GAPDH 抗体（美国CST，货号5174），Bax 抗体（美国Proteintech，货号50599-2-Ig），HRP标记山羊抗兔IgG抗体（美国CST，货号7074）。小动物超声影像系统（美国GE，型号VIVID5），小动物麻醉机、呼吸机（上海玉研，型号分别为ABS-100、SAR-100），动物用心电图机（深圳邦健，型号ECG-101G），多功能酶标仪（美国BioTek，型号Synergy H1），化学发光成像系统（上海天能，型号4600SF）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

60只大鼠随机分为假手术组、模型组、鹿红方组和培哚普利组，每组15只。除假手术组外，其余大鼠参照文献[9]方法通过结扎左冠状动脉前降支（LAD）制备心力衰竭模型。大鼠术前禁食12 h，异氟烷吸入麻醉，连接呼吸机，于左胸第3、4肋间靠近胸骨处剪开皮肤，打开胸腔，去除心包膜，在左心耳下缘2 mm处用6-0号带针丝线结扎LAD，结扎成功可见心尖部变白、心电图Ⅱ导联ST段明显抬高。将心脏复位，关闭胸腔，逐层进行缝合。术后连续7 d肌肉注射青霉素（40万U/d）预防感染。假手术组仅穿线不结扎，其余操作步骤同前。

术后第2日开始灌胃，按照人与动物体表面积法换算给药剂量，鹿红方组给药剂量为2.76 g/（kg·d），培哚普利组给药剂量为0.72 mg/（kg·d），灌胃体积1 mL/100 g，假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，连续8周。

2.2 超声检测

末次给药结束后，大鼠异氟烷吸入麻醉，采集M型超声图像，检测大鼠心脏左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室舒张末期内径（LVIDd）和左室收缩末期内径（LVIDs），评价大鼠心功能和结构。

2.3 ELISA检测

BNP由心室肌细胞分泌，是目前心力衰竭诊断、评估病情与预后的常用指标，与疾病的严重程度呈正相关。超声检测结束后，行腹主动脉穿刺采血，常温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离上清液，按试剂盒说明书检测大鼠血清BNP含量。

2.4 HE和Masson染色

腹主动脉取血结束后，迅速摘取大鼠心脏，用预冷生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。常规脱水，石蜡包埋，切片，分别进行HE 染色和Masson染色，观察心肌组织病理改变和纤维化情况。采用Image J软件计算心肌纤维化面积，心肌纤维化面积（%）＝胶原面积÷视野总面积×100%。

2.5 TUNEL检测

取大鼠心肌组织石蜡切片，脱蜡至水，蛋白酶K进行抗原修复，破膜，加TUNEL显色反应液，37 ℃孵育2 h，DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像，每张切片选取3个不重叠视野，采用Image J软件计算心肌细胞凋亡指数。心肌细胞凋亡指数（%）＝凋亡细胞数÷总细胞数×100%。

2.6 Western blot检测

取50 mg心肌组织，加入裂解液裂解，BCA法测定蛋白浓度。凝胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜，5%BSA 室温封闭2 h，TBST 洗膜7 min×3 次，滴加PI3K 一抗（1∶1 000）、AKT 一抗（1∶1 000）、p-AKT一抗（1∶2 000）、Bcl-2一抗（1∶1 000）、Bax一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶2 000），4 ℃冰箱孵育过夜。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加相应二抗（1∶3 000），常温孵育2 h。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加ECL 发光液，化学发光成像系统获取图像，以GAPDH为内参，Image J软件计算各条带灰度值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 鹿红方对模型大鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明显升高（＜0.01），提示长期容量负荷超载导致大鼠左心功能降低，心脏结构发生改变，心力衰竭模型复制成功。与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠LVEF、LVFS明显升高（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明显降低（＜0.01）；与鹿红方组比较，培哚普利组大鼠LVEF、LVFS明显升高（＜0.05），LVIDd、LVIDs差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较（）

4.2 鹿红方对模型大鼠血清B型利钠肽含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清BNP含量明显增加（＜0.01）；与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠血清BNP含量明显减少（＜0.01）；鹿红方组与培哚普利组差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清BNP含量比较（，ng/L）

4.3 鹿红方对模型大鼠心肌组织病理变化的影响

HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排序有序，形态、结构正常，细胞核致密清晰；模型组大鼠心肌组织有不同程度变性、坏死，心肌细胞排列紊乱、结构模糊，局部心肌细胞消失，被增生的结缔组织取代，有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠心肌组织病理损伤均明显改善，心肌细胞水肿、坏死明显减轻，排列略不规则，有少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态（HE染色，bar=200 μm）

4.4 鹿红方对模型大鼠心肌纤维化的影响

Masson染色中正常大鼠心肌组织呈红色，胶原纤维呈蓝色。结果显示，假手术组大鼠心肌组织仅在血管周围有少量散在的胶原纤维沉积；与假手术组比较，模型组大鼠胶原纤维沉积严重，心肌纤维化面积明显增加（＜0.01）；与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠心肌组织胶原纤维沉积明显减轻，心肌纤维化面积明显减少（＜0.05）；鹿红方组与培哚普利组比较差异无统计学意义（＞0.05）。结果见图2、表3。

表3 各组大鼠心肌纤维化面积比较（，%）

图2 各组大鼠心肌组织形态（Masson染色，bar=3 mm）

4.5 鹿红方对模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色中阳性凋亡细胞核呈绿色荧光。结果显示，假手术组大鼠仅有少量心肌细胞凋亡；与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡增加，心肌细胞凋亡指数明显升高（＜0.01）；与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠心肌细胞凋亡指数明显降低（＜0.01）；鹿红方组与培哚普利组比较差异无统计学意义（＞0.05）。结果见图3、表4。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，bar=20 μm）

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较（，%）

4.6 鹿红方对模型大鼠心肌组织PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织PI3K、p-AKT、Bax蛋白表达明显升高（＜0.01，＜0.05），Bcl-2 蛋白表达明显降低（＜0.01）；与模型组比较，鹿红方组和培哚普利组大鼠心肌组织PI3K、p-AKT、Bax 蛋白表达明显降低（＜0.01，＜0.05），Bcl-2蛋白表达明显升高（＜0.01）；鹿红方组与培哚普利组差异无统计学意义（＞0.05）。见图4、表5。

图4 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠心肌组织PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达比较（）

5 讨论

心力衰竭发病机制复杂，涉及病理因素众多。目前认为，心室重构是心力衰竭发生发展的基本机制，心肌细胞凋亡是心室重构的重要病理基础。正常情况下，细胞凋亡一般在衰老的细胞中发生，是机体维持细胞动态平衡的自我保护机制。当受到缺血、缺氧等损伤刺激时，机体氧化应激水平增加、炎症因子增多、细胞膜完整性及稳定性被破坏，导致细胞凋亡发生。心肌细胞过度凋亡可使心肌细胞数量骤减，心脏收缩与舒张功能失常，最终导致心腔扩大、心室壁变薄、心肌肥大等心肌重构的病理表现。因此，有效抑制心肌细胞凋亡对心力衰竭的防治和预后具有积极意义。

PI3K/AKT信号通路具有多种效应功能，在调节血管再生、内皮细胞功能、心肌细胞凋亡及糖脂代谢中具有重要作用，其对凋亡的调控主要体现在直接或间接调节Bcl-2/Bax蛋白表达。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起重要作用，Bcl-2、Bax蛋白表达水平与凋亡调控直接相关。PI3K是由催化亚基（p110）和调节亚基（p85）两部分构成的二聚体蛋白，当接收到刺激信号时，机体可通过2条途径将底物二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转变为三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）而活化，活化后的PIP3进一步与AKT结合，使AKT募集到膜上而磷酸化激活。AKT磷酸化（p-AKT）水平是PI3K/AKT信号通路活化的重要标志之一。研究表明，长期心力衰竭患者心肌组织p-AKT水平显著升高，经左室辅助装置治疗后心肌组织p-AKT水平下降，心肌肥厚减轻，心功能得到改善。研究发现，心力衰竭模型小鼠p-AKT水平明显升高，可诱导Bax表达，促进心肌细胞凋亡，而抑制p-AKT表达可有效改善模型小鼠心功能，减少心肌细胞凋亡，减轻心肌肥厚。

中医学认为，心力衰竭为本虚标实之证，本虚以心气虚、心阳虚为主，标实以水饮、瘀血、痰浊为患。由于“心肾相交”“水火既济”，心阳虚不能下归于肾，导致肾阳渐虚，肾阳虚衰又无以温煦心阳，终致心肾阳虚。肾阳为一身阳气之本，“五脏之阳气非此不能发”。因此，心力衰竭中医治疗强调“心肾同治”，鹿红方正是在此理论基础上创制而成。方中鹿角片温阳补肾、行血消肿，红花活血袪瘀通经，二者共为君药；补骨脂、淫羊藿助君药温肾助阳之力，二者皆为臣药；山萸肉、女贞子补益肝肾之阴阳，沉香温肾纳气平喘，三药合用调补阴阳，共为佐使药。诸药合用，共奏温肾强心、活血通络功效。

本实验以LAD结扎法制备心力衰竭大鼠模型，以鹿红方干预，发现鹿红方可有效提高模型大鼠心功能，降低血清BNP含量，减轻心肌纤维化，抑制心肌细胞凋亡，并且下调PI3K、p-AKT、Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，提示其抗凋亡机制与抑制PI3K/AKT/Bax信号通路活化有一定关系。本研究揭示了鹿红方抑制心肌细胞凋亡的可能作用机制，为其临床应用和深入研究提供一定实验依据。