基于指纹图谱与多成分定量结合化学模式识别技术的彝族药紫地榆质量评价研究

田宇柔，郗仲玟，冯玉，姜晓娅，牛丽颖

1.河北中医学院，河北 石家庄 050091；2.河北省中药配方颗粒技术创新中心，河北 石家庄 050091；3.中药材品质评价与标准化河北省工程研究中心，河北 石家庄 050091；4.河北省高校中药配方颗粒应用技术研究中心，河北 石家庄 050091

紫地榆，又名赤地榆、隔山消，为牻牛儿苗科紫地榆Knuth的干燥根，始载于《滇南本草》，为云南省特有民族药，收载于2005年版《云南省中药饮片标准（第一册）》，其味苦、酸、涩，性微寒，具有凉血止血、解毒敛疮功效。现代研究发现紫地榆主要含有鞣质、酚酸类、黄酮类等化学成分，具有抗炎镇痛、止血、防龋、抗氧化等药理作用。现行地方标准对其炮制、性状等鉴定部分进行了相关规定，但缺乏化学成分质量分析控制，且现有文献对紫地榆质量研究不足，仅对部分化学成分进行含量测定，难以对不同产地药材的差异性进行全面评价。

近年来，指纹图谱与多成分定量分析相结合的中药质量控制模式广泛用于中药材质量评价，化学模式识别技术在基源鉴别、炮制研究、真伪鉴定、产地分析等方面发挥着重要作用，常用方法包括聚类分析、主成分分析、判别分析、偏最小二乘判别分析（PLSDA）等。在进行中药指纹图谱的建立与多成分定量的同时，结合化学模式识别技术对数据图谱信息进行分析处理，能够更加科学客观地对中药质量进行分析评价与控制。因此，本研究建立彝族药紫地榆HPLC指纹图谱，同时对6种指标性成分进行含量测定，通过SIMCA14.1软件进行化学模式识别，以期对不同产地的紫地榆药材进行质量评价，为其质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津公司；CPA225D型电子天平、BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯有限公司；KQ-250E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品没食子酸（批号110831-201605，纯度90.8%）、鞣花酸（批号111959-201903，纯度88.8%），中国食品药品检定研究院；儿茶素（批号PS020094）、短叶苏木酚酸（批号PS21054-10）、五没食子酰基葡萄糖（批号PS020247），纯度均为98.0%，成都普思生物科技股份有限公司；柯里拉京（批号111623-200302），中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯），Fisher化学试剂公司，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

15批紫地榆药材由神威药业集团有限公司提供，经楚雄彝族自治州中医医院副主任医师余惠祥鉴定为牻牛儿科紫地榆Knuth的干燥根，来源信息见表1。

表1 15批紫地榆样品来源信息

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液

精密称取没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖对照品适量，加甲醇溶解，制成一定浓度的对照品贮备液；精密吸取上述各对照品贮备液适量，加甲醇稀释，即得浓度为没食子酸48.40 μg/mL、儿茶素135.00 μg/mL、短叶苏木酚酸14.60 μg/mL、柯里拉京128.40 μg/mL、鞣花酸65.20 μg/mL、五没食子酰基葡萄糖140.90 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取紫地榆药材粉末（过40目筛）约0.2 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

采用Thermo Syncronis C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～10%A；5～18 min，10%～12%A；18～35 min，12%～13%A；35～37 min，13%A；37～47 min，13%～15%A；47～57 min，15%～16%A；57～67 min，16%～18%A；67～71 min，18%A；71～75 min，18%～20%A；75～80 min，20%A；80～85 min，20%～80%A；85～88 min，0%～5%A；88～95 min，5%A），流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长270nm，进样量10µL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一批样品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以鞣花酸（19号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取同一批样品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别于制备后0、5、10、14、20、24 h进样分析，记录色谱图。以鞣花酸（19号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批样品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图。以鞣花酸（19号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立及相似度评价

2.4.1 共有峰标定取15批紫地榆药材，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件下测定，得15批样品HPLC色谱图。将所得色谱图导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），S1号色谱图作为参照图谱，以中位数法生成对照图谱，多点校正进行峰匹配，生成叠加图谱（见图1）和对照图谱（见图2），将分离度较好且为主要成分的色谱峰作为共有峰，最终标定21个共有峰。其中19号峰的分离度较好且出峰时间稳定，故设为参照峰（S）。

图1 15批紫地榆样品HPLC指纹图谱

图2 紫地榆HPLC对照图谱

2.4.2 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算相似度，15批样品图谱与对照图谱相似度分别 为0.974、0.982、0.990、0.975、0.989、0.989、0.951、0.908、0.911、0.984、0.984、0.980、0.984、0.985、0.984，均大于0.9，表明不同产地不同批次间紫地榆药材差异性较小，具有良好的一致性。但由于不同产地环境等因素的影响，化学质量仍存在一定差异。

采用对照品对色谱峰进行指认，按“2.2”项下色谱条件进样测定，得到对照品HPLC色谱图（见图3）。最终指认6个特征峰，即2、5、7、10、19、21号峰分别为没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖。

图3 紫地榆中6种成分混合对照品溶液HPLC图

2.5 化学成分含量测定

2.5.1 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液2、4、8、10、12、16、20 μL，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图。以进样量为横色标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程及线性范围（见表2），结果表明6种化学成分在线性范围内呈良好的线性关系。

表2 6种成分线性关系考察结果

2.5.2 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖的峰面积RSD 分别为0.49%、0.48%、0.44%、0.49%、0.48%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

取同一批样品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别在0、5、10、14、20、24 h进样，测定峰面积，没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖的峰面积RSD 分别为0.29%、2.93%、2.95%、1.67%、1.13%、0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

从公式看出所以在气体质量流量Gg和雾化气流流速Vg中，提高雾化气流流速Vg对气体动能增加效果明显。从能量守恒定律可推出，气体的动能增加，相应转化为增大总表面积的表面能。但是这种能量交换过程效率极低，不到1%。

2.5.4 重复性试验

取同一批样品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，计算没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖的峰面积RSD分别为0.37%、0.49%、1.06%、2.04%、2.51%、2.93%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验

取已知含量样品（S3）粉末9 份，每份约0.1 g，精密称定，按各成分含量的50%、100%、150%精密加入已知浓度的对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备并按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖平均加样回收率分别为98.70 %、102.72%、101.31%、102.10%、102.65%、100.12%，RSD分别为1.90%、1.78%、1.50%、1.65%、1.81%、0.54%，表明该方法准确良好。

2.5.6 含量测定

取15批紫地榆药材粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行2份，按“2.2”项下色谱条件测定，计算样品中没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖含量，结果见表3。

表3 15批紫地榆中6种化学成分含量测定结果（mg/g）

2.6 化学模式识别

2.6.1 主成分分析

为进一步探究不同产地批次间紫地榆药材的质量差异性，将15批样品中没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖的含量作为变量导入SIMCA14.1软件进行主成分分析，得分图见图4。提取特征值＞1的2个成分作为主成分1、主成分2，累计贡献率达89.62%（见表4），说明这2个主成分可反映紫地榆药材的整体综合质量。

表4 主成分特征值及方差贡献率

图4 15批紫地榆PCA得分

主成分载荷矩阵可反映各变量对主成分的贡献大小和作用方向，根据因子载荷矩阵（见表5），主成分1与没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、鞣花酸的含量均呈正相关，主成分2与儿茶素、短叶苏木酚酸和五没食子酰基葡萄糖的含量呈正相关。根据各主成分值及贡献率计算综合得分（F），F＝0.514 3F1＋0.381 9F2结果见表6。综合得分排序可反映不同批次紫地榆药材质量，排名越高质量越好。可以看出，S12～S14质量相对较优。

表5 因子载荷矩阵

表6 主成分值及综合主成分值

2.6.2 聚类分析

在SIMCA14.1软件中以6种活性成分的含量为变量，进行系统聚类，结果见图5。类间距离为30时，15批药材可聚为三类：Ⅰ类S1～S6（产地楚雄双柏、楚雄姚安）、Ⅱ类S7～S9（产地丽江宁蒗）、Ⅲ类S10～S15（产地丽江华坪、香格里拉维西）。该结果与主成分分析结果一致。表明同一产地不同批次药材间具有较强相似性，不同产地间则差异较大，分析可能与地理位置、气候等相关。

图5 15批紫地榆聚类分析树状图

2.6.3 偏最小二乘判别分析

在主成分分析、聚类分析基础上，将6种成分含量作为变量导入SIMCA14.1软件进行PLS-DA建模分析，结果见图6。PLS-DA 模型累计解释模型参数RX、RY 分别为0.994、0.753，预测能力参数Q为0.511，均大于0.5，表明该模型预测能力较好，可用于不同产地紫地榆的区分分析。

图6 15批紫地榆PLS-DA得分

变量重要性投影（VIP）可衡量各共有峰的表达模式对样本分类判别的影响强度和解释能力，对于辅助筛选质量差异标志物有较大贡献。本研究在95%置信区间内优先选择VIP＞1.0的成分作为造成不同批次间质量差异的标志性化合物，分别为鞣花酸（VIP＝1.20）、儿茶素（VIP＝1.14）、五没食子酰基葡萄糖（VIP＝1.03）、柯里拉京（VIP＝1.00），这些成分可能是造成不同产区紫地榆质量差异的重要因素，结果详见图7。

图7 紫地榆样品中6种指标成分VIP

3 讨论

紫地榆所含化学成分复杂，本试验将供试品溶液在190～400 nm进行全波长扫描，比较不同波长的色谱峰数目、峰面积及分离度，发现在270 nm波长处各色谱峰峰形较好，分离度高，特征性强。本试验考察了不同流动相系统（乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%磷酸）及比例，结果显示以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，所得各色谱峰峰形较好，分离度高。本试验以指标成分含量为考察指标，对提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）、提取体积（15、25、50 mL）和超声时间（15、30、45 min）进行单因素考察，发现以70%甲醇25 mL为溶媒超声处理30 min时各成分提取率最高。本试验对确定的色谱条件进行了耐用性研究（不同温度、波长、流速、色谱柱），结果均符合要求，表明此方法简便准确，可为紫地榆的质量控制及评价提供参考。

中药化学成分具有多样性与复杂性的特点，且各成分之间具有相互协同作用。多成分的复杂性决定了单一成分指标评价难以表达中药的质量，并由此提出多成分质量控制的模式，应用最为广泛有两类，一类是反映中药化学成分整体模糊信息的指纹图谱方法，另一类是多指标成分同时测定。本研究采用HPLC对15批紫地榆药材进行指纹图谱研究，结果显示15批样品具有良好的相似性，但由于不同产地环境等因素的影响，化学质量仍存在一定差异，故选择没食子酸、儿茶素、短叶苏木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖6种指标成分进行含量测定，所选择的6种成分均有一定的药理活性作用。没食子酸、儿茶素、柯里拉京、鞣花酸、五没食子酰基葡萄糖均为紫地榆中鞣质类化合物，鞣质为紫地榆的有效化学成分，具有抗氧化、防龋、抗菌、抗病毒作用，其中没食子酸、儿茶素和鞣花酸具有较强的抑菌活性，可对致龋菌产生生长抑制、加快衰亡、降低黏附、破坏细胞膜、改变通透性、破坏生物膜完整，以及降低乳酸脱氢酶、蔗糖酶活性的作用。短叶苏木酚酸为酚酸类化合物，罗廷顺等在优化紫地榆多酚提取工艺的基础上，考察其体外抗氧化活性，发现紫地榆多酚清除DPPH和ABTS的能力良好，尤其对ABTS清除能力最优并呈现出良好的量效关系。含量测定结果显示，5种鞣质类指标成分含量均大于短叶苏木酚酸，短叶苏木酚酸含量较低且不同产地样品间各成分含量存在较大差异。

为进一步考察不同产地药材差异，采用主成分分析、聚类分析及PLS-DA方法对紫地榆进行综合质量评价，结果显示S12～S14产地的紫地榆药材质量较优，结合含量测定结果发现，较优产地药材其6种活性成分含量也较高。通过VIP排序，筛选得到影响紫地榆药材质量的4种标志性成分，分别为鞣花酸、儿茶素、五没食子酰基葡萄糖、柯里拉京。本研究所建立的HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法稳定可靠，结合化学模式识别技术可更加全面综合地对紫地榆药材质量进行评价。但由于紫地榆中所发现的化学成分较少，是否存在影响其质量的其他成分尚待确认。后续研究将运用多种分析技术对紫地榆进行全面的化学成分分析，补充化学成分信息库，以期建立更加科学可靠的质量评价标准。