基因检测微流控芯片的研究、应用与发展

刘 宇， GIUSEPPINA SIMONE

(西北工业大学空天微纳系统教育部重点实验室，陕西 西安 710072)

0 引 言

基因(DNA)是人类的遗传密码，从根源上控制着人的生老病死，人类基因组计划的正式完成，极大地推动了基因检测等技术的发展，为人类了解生命本质以及预防疾病提供了方法。但传统的生化检测、染色体分析、DNA分析等基因检测技术往往具有操作难度高、成本高、耗时长、准确度低及性价比低等缺点[1]。而微流控技术很好地解决了这些问题。

微流控是一种全新微量分析技术，具备小剂量分析、快速、低成本、可集成等优势[2]。目前，微流控芯片的应用已经遍及生命科学、医学、化学等领域，相关技术、器件和工艺发展迅速[3]。本文重点对近几年国内外基因检测微流控芯片的研究与应用进行了综述，并对其未来的发展趋势进行了展望。

1 基因检测与微流控检测技术优势

基因检测通常包括提取、扩增和检测三个步骤，传统的基因芯片的工作原理是核酸分子杂交。即制造一个靶基因cDNA片段按特定规律排布的支持物，然后将从体液、唾液等中提取的被检测的DNA或RNA通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，并掺入荧光标记分子探针，然后，根据碱基互补配对原理检测荧光标记，从而获得被检测基因的相关信息。

微流控芯片可以在很短的时间内提取、扩增和检测DNA。将微流控芯片技术应用于基因检测领域具有以下优势：1)降低污染风险：人工操作DNA提取耗时长且测试过程容易受到污染，而集成的微流控芯片可以自动完成各项操作，减少样本污染。2)高通量：微流控芯片可以设计多条微通道[4]，同一个微流控芯片可以对同一样本同时进行不同项目的检测，缩短了检测时间，提高了检测效率。3)试剂消耗少、时间短：非常少的样本和检测试剂即可进行高精度的测试，且由于微流控芯片的微型化提高了传热效率[5]，因此可以更短的反应时间促进DNA扩增，并且由于短的扩散距离，具有更高的响应速度，缩短反应时间。4)操作难度低：集成芯片中的各检测步骤可以全自动进行，降低了传统基因检测的难度。5)成本低：与传统实验室中笨重且昂贵的设备相比，大规模生产技术集成生产的微流体芯片大大降低了生产成本。

2 基因检测微流控芯片的研究现状

2.1 微流控芯片的制作材料

用于制作基因检测微流控芯片的材料主要有单晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。单晶硅是最早适用芯片的基材，加工工艺及设备完善，但硅材料易碎、价格贵、绝缘性差、对PCR反应有抑制作用[6]。石英和玻璃具有很好的抗腐蚀性，且廉价易得，但其加工工艺复杂，也逐渐被人们舍弃。PDMS是目前使用量最多的高分子聚合物材料，其兼具成本低廉、生产规模化等特点，并且具有很好的生物相容性和热稳定性，但其加工工艺较为复杂[7]。

除了传统的制作材料外，纸张也是一种很好的制作微流控芯片的原材料，纸微流控芯片从提出至今虽然只有几十年的发展历程，但其成本低、制作简单、具有很好生物相容性[8]，逐渐受到人们的青睐。除此之外，基于纸张的微流控芯片无需外加驱动装置，可以利用自身的毛细力输送流体。Trieu P T等人[9]研究了一种集成了DNA纯化、环介导等温扩增和现场比色检测的纸质微流控芯片，纸张先通过互补模具压花雕刻理想的几何形状，然后用PDMS进行疏水涂层。

2.2 微流控芯片的制作方法

基因检测微流控芯片的制作方法与主流微流控芯片相同，不同的材料具有不同的制造工艺。硅、玻璃等材料微流控芯片上的微细结构主要采用光刻和蚀刻技术进行加工。高分子聚合材料芯片上的微细结构一般采用模塑法、注塑法、热压法、软光刻、激光烧蚀法等方法制造。近年来，3D打印和丝网印刷技术等新型加工技术开始受到研究者的广泛关注。

3D打印是一种可以在精确的控制下，逐层构建3D物体的增材制造技术，其中可应用于微流控器件制造的是：1)立体光刻;2)多射流建模;3)熔融沉积建模[10]。3D打印技术不但克服了传统制造技术的障碍，而且实现了低成本、快速、一步三维制造[11]，具有广泛的应用前景。

2.3 微流控芯片的驱动方式

2.3.1 微泵驱动

微泵分为机械式和非机械式。机械式微泵主要通过固体或液体运动产生的压差来驱动流体，非机械式微泵主要通过能量传递来驱动流体运动[12]。任芳玲等人[13]利用高密度双锥纳米孔(孔径约为30 nm)的径迹刻蚀薄膜制成了厚度约为12 μm的高性能低压电渗泵芯片，并表现出良好的稳定性。中国科学技术大学的孙仕欣等人[14]基于三腔蠕动微泵的液体回流问题，开发了一种五腔压电蠕动微泵。

2.3.2 磁珠驱动

磁珠驱动的原理是通过操控外加磁场来操控吸附核酸分子的磁珠，从而实现微流体的驱动，其中磁场主要是通过永磁体、电磁体和软磁体来产生[15]。郑州大学的杭跃航等人[16]设计了一种用永磁体产生磁场的表面开放的一体化液滴微流控芯片(图1)，可实现核酸检测的全过程。武汉大学的张作然等人[17]利用了微流控芯片上侧向磁泳的方法，同时分选了乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒反转录DNA。

图1 永磁体微流控芯片结构[16]

2.3.3 离心力驱动

离心力驱动的原理是利用一个电机来产生流体流动所需要的力，相较于其他驱动类型的微流控芯片，离心驱动更多地应用于样品制备的步骤[18]。结合重组酶介导扩增技术，周新丽等人[19]开发了一种集核酸扩增与检测一体的扇形微流控芯片，该扇形微流控芯片受离心力控制。由于该扇形微流控芯片具有多个微小腔室，能够同时检测多个样本的多种指标。

2.3.4 其他驱动方式

Li X等人[20]开发了一种利用拉伸力作为驱动方式的核酸检测微流控芯片，该芯片由3个经不同方式处理的PDMS层制成(图2(a))，样品溶液通过毛细管作用进入微流体通道，应变阀在拉力的作用下打开并产生负压，样品溶液和检测溶液在弹簧泵流道混合并通过弹簧泵产生的动力驱动流体流入检测室(图2(b))，在核酸扩增的过程中，会释放氢离子导致溶液pH值下降，检测液种的pH指示剂的颜色随之变化，从而实现对核酸的检测。

图2 拉伸式核酸检测微流控芯片[20]

3 微流控芯片在基因检测中的应用

3.1 临床医学诊断

3.1.1 遗传病筛查

单核苷酸多态性(SNP)的基因分型是分析许多遗传病的基础。基于SNP分型方法，Lu Y等人[21]提出构建了一种多腔室微流控芯片，用于检测遗传性听力损失。样品在多腔室独立进行等位基因特异性PCR，很好地解决了现有SNP检测方法检测周期长、操作繁琐、残留污染风险高的问题。

3.1.2 癌症诊断

外分泌体及其伴随的蛋白质和核酸被认为是肿瘤诊断的生物标志物，因此，对外分泌体的检测成为了区分癌细胞和正常细胞的重要手段[22]。Qian C等人[23]开发了一种名为isExoCD的琼脂糖微流控芯片，并将外分泌体浓缩和microRNA(miRNA)检测集于一体，入口处加载的目标外分泌体利用毛细管效应和琼脂糖凝胶的透水性自动富集。Gao Y等人[24]提出了一种特异性miRNA定量检测平台，基于三段杂交同时对多个样品中的miRNA进行多重检测，用于乳腺癌的早期诊断。罗丹等人[25]开发了一种对人血浆外泌体中miRNA—21测定的凝胶电泳微流控芯片，对推动外泌体与肿瘤相关研究具有重要的价值。

3.2 病原体检测

传统用于细菌检测方法的平板计数法由于耗时长和灵敏度等问题已经无法满足日益增长的食品安全检查要求[26]。环介导等温扩增(LAMP)技术已成为一种非常有前景的快速灵敏检测病原体的方式[27]。Teixeira A等人[28]将LAMP技术与表面增强拉曼散射相结合开发了的微流控器件实现了对李斯特菌的检测。Jin J等人[29]开发了一种集成LAMP的双样本检测微流控芯片，可同时完成两个样本的22次基因分析，显著提高了检测效率。Yin K等人[30]建立了一种SMCD(多路比色检测)方法用于检测废水中的严重急性呼吸综合征状病毒2型(SARS—Cov—2)，SMCD方法在3D打印的微流控芯片上集成了核酸提取，等温扩增和比色检测，通过智能手机分析记录的实时比色信号便可检测到废水中的SARS—CoV—2病原体。

3.3 生物化学研究

基因检测微流控芯片为体外基因改造分析提供了可能。Wang W等人[31]开发了一种可以对一些化学试剂和辐射对DNA的损伤作用进行评估的微流控芯片(图3(a))，并对工程菌进行了相关实验，对维护长期暴露于太空环境的宇航员的安全和健康提供了基础数据。考虑到微生物耐药性的日益增强对全球公共卫生的威胁，Rodriguez—Manzano J等人[32]开发了基于LAMP的核酸检测微流控芯片设备检测活动性粘菌素的耐药性(图3(b))。

图3 用于生化分析微流控设备实物

4 关键问题与未来发展

4.1 制造材料

制作微流体的理想材料需要具有光学透明性、机械强度高、热稳定性好、易于加工且适合大规模生产，但没有一种材料能同时满足所有这些要求。因此,可以将硅、玻璃、陶瓷、纸张和高分子材料协同使用构造混合器件，发挥其各自的优势。

4.2 3D打印技术

3D打印作为一种新型快速成型技术，具有加工速度快、成本低等优点，目前已经广泛应用于制造微流控芯片的各个领域。但3D打印低的分辨率以及有限的印刷材料限制了其应用。为了实现高分辨率微流控芯片的快速制造，需要发展基于表面投影和逐层光固化的高精度数字光处理(digital light processing,DLP)3D打印技术。相较于传统制备方法，DLP 3D打印技术具有更快的速度、更高的通道精度和更好的安全性能。

4.3 驱动方式

基因检测微流控芯片在工作时通常需要加热模块对核酸进行扩增和外置驱动装置驱动流体检测，但是，对于一些缺乏资源的偏远地区，无法满足床旁检测检测要求。为了实现这类地区的基因检测，可以发展利用人体自身热量驱动核酸扩增的技术，并在此基础上，结合利用毛细作用驱动的纸基微流控芯片，开发利用人体热量驱动的可穿戴纸基基因检测微流控芯片。

5 结束语

1)微流控芯片在基因检测领域的应用，极大提高了基因检测的灵敏度和效率，但微流控芯片的制造材料、制造方法和驱动方式仍是当今研究的重点和难点。

2)目前微流控芯片在基因检测中的应用包括临床医学诊断、病原体检测、生物化学研究和药物筛查。其中临床医学诊断的应用主要集中在遗传病筛查和癌症诊断，微流控芯片的应用很好地改善了传统筛查诊断方式的耗时长、灵敏度低等不足。