一株拮抗美洲南瓜枯萎病菌的内生真菌N-1的鉴定及其生物学特性

李 培年文珠薛应钰陈军宏张 扬黒雅娅

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070)

美洲南瓜(Cucurbita pepo)属于1 a生蔓性草本植物,栽培历史悠久,原产于北美洲,中国最早于19世纪中期引进种植[1-2],目前是仅次于黄瓜的第二大瓜类蔬菜[3]。其营养丰富,味道鲜美,食用方法多样,具有极高的食用和药用价值,深受消费者的青睐。2018 年甘肃省南瓜种植面积约8.7×103hm2,武威市作为无壳美洲南瓜的优势产区,常年种植面积大于2.7×103hm2[4],美洲南瓜已成为当地农民增收致富的支柱产业。然而,随着美洲南瓜种植面积的扩大和多年连作栽培,由尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)引起的枯萎病日趋严重,一般可导致减产20%～30%,严重时可达50%～60%,尤其是连作地块可导致全田绝收[5]。防治枯萎病已成为当地美洲南瓜生产中亟待解决的重要问题之一。

枯萎病是一种土传病害,生产中主要采用化学措施防治,如用高锰酸钾或多菌灵浸种,用多菌灵苗床消毒,用棉隆、异氰尿酸、含氯药剂等处理土壤[6]。但是,长期大量使用化学农药容易造成污染环境、破坏生态、危害健康和病原菌产生抗药性等一系列问题[7]。生物防治具有高效、安全和环境友好等特点且符合国家“减肥减药”战略和发展绿色农业等的要求,其在植物病害防治中的应用已成为目前研究的热点[8]。目前,瓜类枯萎病的拮抗微生物中以细菌居多,尤其以芽孢杆菌应用最为广泛,赵佳等[9]报道解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lh-1 对西瓜枯萎病的防治效果达78.5%。季倩茹等[10]研究表明,多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)B207、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)B213 和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B204 单独或组合施用后能有效抑制黄瓜枯萎病的发生,3种菌剂联用处理后黄瓜枯萎病的发病率降低79.99%。另外,生防真菌在瓜类枯萎病的防治也有报道,Pu等[11]通过根际接种非致病性尖孢镰孢菌CS-20,发现黄瓜枯萎病的病情指数降低18.83～61.67;刘佳等[12]研究表明,长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,抑菌率达60.09%。但是,应用植物内生真菌防治瓜类枯萎病的报道较少。植物内生真菌是存在于健康植物的组织和器官内部对寄主不形成明显侵染的真菌[13],它与寄主植物之间存在着互惠互利的共生关系。据报道,目前已发现的内生真菌中,大约有1/3对植物病原真菌具有较强的抑制活性[14]。因此,本研究以一株分离自美洲南瓜的内生真菌N-1为试验材料,测定其对美洲南瓜枯萎病的拮抗效果,通过形态学和分子生物学手段确定其分类地位并研究其生物学特性,以期为南瓜枯萎病的生物防治提供新的材料,也为内生生防真菌的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 内生真菌N-1菌株(分离自美洲南瓜根部)和美洲南瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌(F.ox ysporum)保存于与甘肃农业大学植物保护学院植物病原学实验室。

1.1.2 供试培养基 供试7 种培养基,包括PDA、GA、Czapek、SYA、SDAY、LB和PA,按照方中达[15]植病研究法配置培养基,灭菌后常温保存,备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株N-1对南瓜枯萎病菌的拮抗作用

菌株N-1活菌对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用:利用平板五点对峙培养法[16]测定菌株N-1对南瓜枯萎病菌的拮抗作用。分别培养菌株N-1 和南瓜枯萎病菌菌株5 d后,用5 mm 打孔器打取美洲南瓜枯萎病菌菌饼接到PDA 平板中央,菌株N-1接到枯萎病菌四周距离南瓜枯萎病菌15 mm 处,以接种PAD 菌饼为对照,用“十字交叉法”测量南瓜枯萎病菌菌落直径,计算抑菌率。

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/处理菌落直径×100%

菌株N-1 发酵液对美洲南瓜枯萎病菌菌落生长的影响:采用菌丝生长速率法[17]。菌株N-1在PDA 培养基培养5 d后,接入到80 m L PDB液体培养基中,于28 ℃、180 r/min的摇床振荡培养7 d,8 000 r/min离心15 min取上清液,将上清液通过孔径为0.22μm 的细菌过滤器过滤得到无菌发酵液。将一定量无菌发酵液与冷却至45 ℃左右的PDA 培养基充分混匀,使发酵液在培养基中稀释终浓度分别为0、10、50和100倍,倒培养皿,每皿20 m L,待凝固后备用。用直径5 mm 的无菌打孔器在培养7 d 的美洲南瓜枯萎病菌菌落边缘打取菌饼。然后将菌饼置于含有发酵液的PDA 平板中央,以含无菌水的PDA 平板作为对照,每个处理重复3 次。28 ℃恒温培养5 d后,采用“十字交叉法”测量菌落生长量。按公式计算菌落生长抑制率。并用光学显微镜观察枯萎病菌菌丝的变化,最后用Canon 100D 照相机和Nikon E200-2MV-U2生物显微成像分析系统拍照。

菌株N-1 发酵液对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发的影响:用PDB稀释菌株N-1发酵液使其终浓度分别为0、10、50 和100 倍,分别吸取1 m L发酵液于无菌凹玻片中,然后吸取100μL预先制备好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液(浓度为1×108个/m L)分别加入到盛有不同稀释倍数发酵液的凹玻片中,28 ℃恒温培养8 h后,在光学显微镜下观察分生孢子的萌发情况,共观察5个视野,每个视野观察20个孢子,统计萌发孢子数。以无菌水作为对照,每个处理重复3次,按如下公式计算孢子萌发抑制率:

孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发数-处理孢子萌发数)/对照孢子萌发数×100%

菌株N-1 发酵液对美洲南瓜枯萎病的盆栽防效测定:选取健康饱满的美洲南瓜种子,品种为‘光板’(由甘肃武威金苹果公司提供),先用75%酒精消毒3 min后,接着用无菌水冲洗干净,摆放于铺有无菌滤纸的培养皿中,将培养皿置于25 ℃、12 h光照、12 h黑暗的培养箱中催芽,培养7 d后选取出芽一致的种子播种于装有灭菌营养土的花盆中。待长至4～5叶期时,选取长势一致的美洲南瓜幼苗从花盆中挖出,冲洗根部并用无菌滤纸吸干多余水分,然后用无菌剪刀将须根剪掉2 mm,将根部有伤口的幼苗植株根部浸泡在预先配置好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液中30 min,将美洲南瓜幼苗重新栽入花盆中,3 d后灌入配置好的菌株N-1发酵液原液100 m L,以灌入等量的无菌水作为对照,培养1周后观察发病情况并计算发病率和病情指数[18]。病情分级标准参照南宇航等[19]的方法进行。每个处理20株,重复3次。

发病率=发病株数/调查总株数×100%

4）日作业暴露面：根据该设备设计参数，一次性堆高5m，每日暴露面可以控制在40m×10m×5 m或20 m×20 m×5 m，减少控制晚间喷药除臭的成本。

病情指数=Σ(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100

1.2.2 菌株N-1的鉴定 形态学观察:将菌株N-1在28 ℃黑暗下培养5 d,“十字交叉法”测定菌落的生长直径,描述菌落形态、菌落正反面颜色和气味等。挑取28 ℃黑暗培养5 d的PDA 平板上的菌落,进行显微观察产孢情况、孢子的大小以及菌丝形态。

分子生物学鉴定:从形态学鉴定所用的活化菌株上刮取适量菌丝体,进行分子学鉴定,由北京擎科生物科技有限公司西安分公司利用真菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌株N-1的基 因 组 总DNA,采 用 真 菌 通 用 引 物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR 扩增菌株N-1的ITS r DNA 并进行序列测定。将菌株N-1 ITS r DNA 拼接序列的测定结果用BLAST 工具在GenBank 数据库中进行同源序列对比,利用BLAST 的结果,通过MEGA 7.0软件构建菌株N-1的系统发育树。

1.2.3 菌株N-1 生物学特性 p H 对菌株N-1生长及产孢的影响:配置PH 分别为4、5、6、7、8、9和10的PDA 培养基,将5 mm 菌株N-1菌饼接种于培养基中,每个处理5个重复,28 ℃恒温培养5 d,记录数据并计算菌株生长速率及产孢量[20]。

不同培养基对菌株N-1生长及产孢的影响:将在PDA 培养基培养5 d的菌株N-1打成5 mm菌饼,接种在6 种培养基平板中央:PDA、SYA、Czapek、GA、SDAY 和LB,28 ℃培养5 d,每个处理5次重复,“十字交叉法”测量菌落直径,记录数据并计算生长速率。利用直径为5 mm 打孔器在菌落中央至边缘1/2处打取菌饼,挑取菌饼于50 m L离心管内,加入10 m L 0.05%吐温-80无菌水,振荡充分后用血球计数板计数,计算产孢量。

氮碳源对菌株N-1 生长及产孢的影响:以2%葡萄糖作为碳源,分别添加2%(质量体积比)尿素、硝酸钾、酪氨酸和硝酸钠,28 ℃培养5 d,测定氮源对菌株N-1生长及产孢的影响。

将PA 培养基作为基础培养基,分别添加2%(质量体积比)葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露糖、果糖、肌醇和木糖,配置成7种培养基,分别对菌株N-1进行打孔、接种并测量。

温度对菌株N-1生长及产孢的影响:将菌株N-1接在PDA 培养基上,分别置于25、28、30、35和40℃培养箱中培养5 d,每个处理5个重复,记录数据并计算菌株生长速率及产孢量。

1.3 数据统计和分析

试验数据的整理及图表的制作采用Excel 2010和Origin 2018,数据的处理及显著性分析采用SPSS 24.0单因素方差分析(Duncan’s新复极差法)。

2 结果与分析

2.1 菌株N-1活菌对南瓜枯萎病菌的拮抗作用

通过五点对峙法将菌株N-1 和美洲南瓜枯萎病菌在PDA 平板上对峙培养发现,菌株N-1对美洲南瓜枯萎病菌的生长具有明显的抑制作用,抑菌率为75.93%。

2.2 菌株N-1发酵液对南瓜枯萎病菌菌落生长的影响

由表1可知,菌株N-1不同稀释倍数的发酵液对美洲南瓜枯萎病菌菌落生长均有一定的抑制作用,而且随着发酵液稀释倍数的增加,其对美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率呈现逐渐降低的趋势。其中发酵液原液的抑制效果最好,培养5 d的菌落直径为11.31 mm,抑制率最大,达70.94%,100倍发酵液对美洲南瓜枯萎病菌的抑制效果最差,菌落直径为55.14 mm,抑制率仅为24%。显微观察发现,菌株N-1对美洲南瓜枯萎病菌的生长具有显著影响。与对照正常生长的美洲南瓜枯萎病菌菌丝(图1-A)相比,受菌株N-1抑制的枯萎病菌菌丝(图1-B、1-C)出现原生质浓缩,扭曲变形,分支增多,节间缩短,部分断裂等现象。

图1 与菌株N-1对峙培养中美洲南瓜枯萎病菌菌丝形态Fig.1 Inhibition effect of strain N-1 on mycelia morphology of F.oxysporum

表1 菌株N-1对美洲南瓜枯萎病菌的抑制率Table 1 Inhibition rate of strain N-1 on F.oxysporum

2.3 菌株N-1发酵液对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发的影响

结果表明,菌株N-1不同稀释倍数的发酵液均能够对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发产生抑制作用,而且随着稀释倍数的增大,菌株N-1 发酵液对分生孢子萌发的抑制率逐渐降低。原液(稀释倍数为0)的抑制率最大,为82.87%;100倍发酵液的抑制率最低,仅为31.38%(图2)。

图2 菌株N-1发酵液处理后美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发情况Fig.2 Inhibition effect of strain N-1 fermentation liquid on spore germination of F.oxysporum

2.4 菌株N-1发酵液对美洲南瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效结果表明,菌株N-1发酵液对美洲南瓜枯萎病具有明显的防治效果,经灌根处理7 d后,美洲南瓜枯萎病的发病率和病情指数分别为21.67% 和19.38,显著低于对照的发病率(85.00%)和病情指数(82.17),其防效达76.41%(表2)。

表2 菌株N-1发酵液对美洲南瓜枯萎病的盆栽防效Table 2 Control effect of fermentation broth of strain N-1 on Fusarium wilt of Cucurbita pepo in potted experiment

2.5 菌株N-1的鉴定

该菌株在培养基于28 ℃培养5 d后,菌落灰绿色,直径57～64 mm,菌落质地丝绒状。分生孢子梗茎壁光滑;顶囊烧瓶状,直径26.1～30.4 μm,直立于胞梗茎上;瓶梗单层,大小(11.3～13.9μm)×(16.5～19.1μm);瓶梗排列紧密,形成柱形的分生孢子头;分生孢子绿色,球形,直径4.2～4.6μm(图3),初步鉴定为曲霉属(Aspergillussp.)。将菌株N-1 ITS r DNA 拼接序列的测定结果用BLAST 工具在GenBank 数据库中进行同源序列对比,构建N-J系统进化树(图4),菌株N-1与菌株Aspergillus fumigatus(KT229360.1)序列的相似度达到100%,结合形态学特征将菌株N-1鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。

图3 菌株N-1在PDA培养基生长5 d的形态Fig.3 Morphological characteristics of strain N-1 on PDA medium for 5 days

图4 N-1菌株的系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of strain N-1

2.6 菌株N-1的生物学特性

2.6.1 不同p H 对菌株N-1生长及产孢的影响不同p H 对菌株N-1 生长及产孢有显著影响(图5)。该菌在p H 为7时菌丝生长和产孢量最佳,5 d的菌落直径为7.36 cm,产孢量为2.32×107个/m L,p H=8 时次之,5 d 的菌落直径为6.37 cm,产孢量为2.07×107个/m L,p H 为4时最差,5 d 的菌落直径为2.53 cm,产孢量为1.33×106个/m L。

图5 不同p H 下菌株N-1 生长与产孢Fig.5 Growth rate and spore production of strain N-1 on different p H

2.6.2 不同培养基对菌株N-1生长及产孢的影响 不同培养基对菌株N-1生长及产孢均有显著影响(图6),在大多数培养基上生长良好,在SDAY 培养基上生长最快,5 d 的菌落直径为7.17 cm,产孢量为2.73×107个/m L,PDA 培养基次之,5 d 的菌落直径为7.36 cm,产孢量为2.32×107个/m L,GA 培养基生长最慢,5 d的菌落直径为4.33 cm,产孢量为8.16×106个/m L。

图6 不同培养基下菌株N-1的生长与产孢Fig.6 Growth rate and spore production of strain N-1 on different media

2.6.3 不同氮源对菌株N-1生长及产孢的影响

试验表明,菌株N-1在含酪氨酸的培养基上生长最佳,5 d 的菌落直径为2.87 cm,产孢量为6.83×106个/m L,在含尿素的培养基上不生长(图7)。

图7 不同氮源下菌株N-1的生长与产孢Fig.7 Growth rate and spore production of strain N-1 on different nitrogen sources

2.6.4 不同碳源对菌株N-1生长及产孢的影响

研究结果表明,不同碳源对菌株N-1的生长有显著影响(图8)。在含葡萄糖的培养基上生长最好,5 d的菌落直径为7.07 cm,产孢量为2.32×107个/m L,含甘露醇的培养基上生长最差,5 d的菌落直径为2.77 cm,产孢量为3.67×106个/m L。

图8 不同碳源下N-1菌株的生长与产孢Fig.8 Growth rate and spore production of strain N-1 on different carbon sources

2.6.5 不同温度对菌株N-1生长及产孢的影响菌株N-1的生长及产胞在不同温度下存在显著差异,其生长趋势随温度的变化基本一致(图9),在30～35 ℃时生长较为适宜,最适温度为35 ℃,5 d 的菌落直径为7.43 cm,产孢量为2.48×107个/m L。

图9 不同温度下菌株N-1的生长与产孢Fig.9 Growth rate and spore production of strain N-1 on different temperatures

3 结论与讨论

枯萎病是为害美洲南瓜产业的第一大土传性病害,利用功能微生物控制该病害被认为是有效的途径之一。大量研究表明,植物内生真菌在促进植物生长、抗逆和抗病等方面发挥着重要的作用,尤其是对多种植物病原真菌具有专一拮抗或广谱抗性[21-23]。本研究将一株分离自美洲南瓜根部的内生真菌N-1菌株通过形态学和分子生物学方法鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。关于烟曲霉应用于植物病害的防治已有报道,周晓见等[24]报道对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有稳定的拮抗作用的烟曲霉3F30菌株,其抑菌圈为10.0 mm;彭阁等[16]从烟草黑胫病发病植株根际土壤中分离筛选出1株烟曲霉GZ-3菌株,对烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)有明显抑制作用,其对烟草黑胫病田间防治效果为61.82%。本研究表明,烟曲霉N-1菌株对美洲南瓜枯萎病菌菌落生长的抑制率为70.94%,分生孢子萌发抑制率达82.87%,室内盆栽相对防效达76.41%,优于刘佳等[12]报道的长枝木霉T6 菌株对美洲南瓜枯萎病的防效(69.06%),说明烟曲霉可作为美洲南瓜枯萎病防治的一个新的菌种资源,在防治美洲南瓜真菌病害方面具有潜在的应用价值。

研究生防菌的培养条件可以为进一步提高菌体的生长量、抗菌活性物质的产量及生防效果奠定基础[25]。本研究结果表明,碳源、氮源、温度和p H 等因素对烟曲霉N-1 菌株的生长有较大影响,最佳生长培养基为SDAY 培养基,生长的最适温度为35 ℃;在p H 为4～10条件下菌落均可生长,以p H 为7时最适生长;可以利用的最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和酪氨酸,这为烟曲霉N-1菌株的进一步开发利用提供了理论依据。

另外,由于生防菌应用于田间受到多种因素的影响,因此,需要在不同条件下进行系统化地田间试验。同时,深入开展N-1菌株抗菌活性次生代谢产物、在土壤中的定殖能力及其防病机理,进一步验证该菌株的实际生防效果。