不同施肥组合对木里矿区人工植被和土壤微生物特征的影响

张玉芳李希来高志香张 静周 伟张 英

(1.青海大学 农牧学院,西宁 810016;2.青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,西宁 810016;3.中国地质大学 土地科学技术学院,北京 100083)

青海木里矿区由于煤矿企业开采,堆积了大量渣山,重构渣山土壤和恢复其理化性质是保障植被正常生长的重要措施,施肥可改善矿区重构土壤理化性质促进植被生长,微生物群落状况可作为反映重构土壤质量状况指标。杨鑫光等[1]在高寒矿区植被恢复研究中发现,煤矿开采堆积的渣土土壤全氮、全磷及有机质含量低于周边自然草地,p H 高于周边自然草地,而土壤养分及酸碱度对植被恢复有重要作用。施用有机肥能增加土壤养分,硫酸亚铁可以改善土壤p H,继而促进植被生长。

工业脱硫废弃物[2]和碳酸钙[3]等土壤改良剂被用来改良酸性土壤,生物炭[4]等被用来改良碱性土壤。矿区土壤有机肥相关研究中,薛玉晨等[5]和韩阳[6]通过施用猪粪、牛粪及鸡粪来改善矿区土壤性质,但并未涉及土壤改良剂和有机肥梯度研究。目前,国内对高寒煤矿区生态恢复的研究主要有不同坡向渣山植被和土壤特征研究[7],人工种草对土壤特征的影响[8],不同人工恢复措施[9]对高寒矿区煤矸山植被和土壤恢复的效果研究,以及不同恢复年限对高寒露天煤矿区渣山植被和土壤特性的影响[10]等。对不同施肥组合下高寒矿区渣山土壤重构过程中表层土壤微生物群落特征和植被生长特征的研究鲜见报道,本试验试图研究不同有机肥和硫酸亚铁处理组合对高寒矿区渣山重构土壤细菌、真菌群落特征以及植被生长特征的影响,为高寒矿区渣山生态恢复和土壤重构提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

研究区位于青海湖上游江仓矿区(99°27′E～99°35′E,38°02′N～38°03′N),海拔3 800～4 200 m,年平均气温-2.8 ℃。矿区东西长约25 km,南北宽约2.5 km,面积约5 500 hm2,蕴藏着巨大煤炭资源。该矿区自2010年以来,因开采而堆积形成两座体积约为130×104m3的渣山,对当地生态系统造成了一定的破坏。企业自2013年开始进行渣山稳定处理和复绿工作。矿区周边主要草地类型是高寒沼泽湿地,属于多年冻土区,优势种主要有藏嵩草(Koeleria tibetic)、苔草(CarexL.)、粗喙苔草(Carex scabrirostris)。渣山植被恢复前表土理化性质为全氮1.09 g/kg、全磷0.99 g/kg、碱解氮18 mg/kg、速效磷1.7 mg/kg、有机质62.52 g/kg、p H 8.59、水分含量11.9%。

1.2 试验设计

按照双因素随机区组设计试验,有机肥施肥量设置4 个水平,分别为0 kg/m2(M0)、1 kg/m2(M1)、2 kg/m2(M2)、3 kg/m2(M3);硫酸亚铁施肥量设置3 个水平,分别为0 g/m2(F0)、50 g/m2(F1)、100 g/m2(F2),共12个处理(M0F0、M0F1、M0F2、M1F0、M1F1、M1F2、M2F0、M2F1、M2F2、M3F0、M3F1和M3F2),每个处理重复3次。区组间距2 m,每个区组内设有12个间距1 m、面积为4 m×5 m 的小区。

1.2.1 试验方法 2019-06-07清除地面石块,耙地平整地面,施氮肥(尿素)37 g/m2、磷肥(过磷酸钙)40g/m2、钾肥(硫酸钾)37 g/m2作为种肥,将不同剂量有机肥和硫酸亚铁按试验设计施入各小区,后将垂穗披碱草(Elymus nutansGriseb)、青海冷地早熟禾(Poa crymophilacv.Qinghai)、同德小花碱茅(Puccinellia tenuifloracv.Qinghai)、青海中华羊茅(Festuca sinensisKeng cv.Qinghai),按3∶1∶1∶1的比例,混匀后撒播于每个小区,播量为150 kg/hm2,人工耙地,播后对小区进行覆盖无纺布处理。2019年8月下旬,采集试验小区和附近自然山体微生物样品,观测植被恢复状况,对比各试验处理与附近自然山体微生物群落差异。

1.2.2 土壤样品采集及保存 采样前戴无菌手套,对采样勺子进行酒精消毒避免污染;采样时,用勺子在小区四角及中心位置进行采样,各点分别取0～5 cm 土层的鲜土放在同一无菌袋中,排出气体后封好无菌袋袋口,立即转入低温储存箱。下一个样区采样前对勺子同样进行酒精消毒,保证无菌袋内的微生物来源于同一试验小区,然后依次对36个小区和附近自然山体0～5 cm 表土层取样,微生物分析样品放入-80 ℃冰箱保存,交由北京奥维森公司进行扩增子测序。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 微生物分析 分析微生物的OTU、多样性(Chao1指数和Shannon指数)、样本组成相似性(NMDS)、物种组成分类(门和属)。

将提取到的细菌基因组DNA,对16S r RNA V3-V4 区进行扩增,引物序列为GTACTCCTACGGGAGGCAGCA,GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT;真菌基因组DNA,对ITS1-ITS2进行扩增,引物序列为CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA,TGCGTTCTTCATCGATGC。

1.3.2 植被调查 每试验小区随机设置3个50 cm×50 cm 的样方,用钢尺测定每个样方内植被高度;采用目测法估测群落的盖度;采用刈割法齐地面剪取样方内的所有植被,现场测定植被地上生物量并记录。

1.4 数据分析

采用WPS 2019进行数据整理及作图,运用DPS 9.50软件进行不同施肥处理下植被生长状况、微生物生长特性的双因素方差分析,用SPSS.20软件进行Pearson相关分析,Canoco 5.0进行冗余分析。数据以“平均数±标准差”形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对植被生长的影响

地上生物量在有机肥处理下发生极显著变化(P<0.01),由图1可知有机肥M1、M2、M3处理下地上生物量均高于对照组M0,其中在M3处理下达到最大值,为419.39 g,是M0的3.7倍;植被高度在有机肥处理下变化显著(P<0.05),其中M3是M0的2.1倍;植被盖度在有机肥处理下发生极显著变化(P<0.01),表现为M3>M2>M1>M0,M3是M0的6.2倍。硫酸亚铁和有机肥的互作处理对植被地上生物量、植被高度和植被盖度影响不显著(P>0.05)。以上结果表明,有机肥对植被影响最大,以M3的处理效果最好。

图1 不同施肥处理下植被特征变化Fig.1 Changes of vegetation characteristics under different fertilization treatments

2.2 不同施肥处理下微生物多样性指数分析

2.2.1 不同施肥处理对细菌丰富度及多样性的影响 由图2可知,有机肥和硫酸亚铁处理对细菌OTUs的影响极显著(P<0.01),互作处理对细菌OTUs的影响显著(P<0.05)。有机肥处理M1、M2、M3 细 菌 OTUs 分 别 比 M0 高 出24.3%、32.4%、29.0%;硫酸亚铁F1 处理效果最好,细菌OTUs达到1 564.25,比对照组高出12.52%;互作处理M2F1和M3F0分别比M0F0下细菌OTUs高出63.34%、61.71%。

图2 不同施肥处理细菌特征Fig.2 Bacterial characteristics under different fertilization treatments

有机肥处理对细菌丰富度(Chao1)的影响极显著(P<0.01),硫酸亚铁和互作处理对细菌丰富度的影响显著(P<0.05)。有机肥处理下,施肥量从1 kg/m2增加到3 kg/m2,细菌丰富度提高22.76%～29.67%,硫酸亚铁处理F1比F0高出13.17%,互作处理M2F1下Chao1指数达到2 527.62,比M0F0高出72.4%。

有机肥和硫酸亚铁处理对细菌多样性(Shannon指数)的影响极显著(P<0.01),互作处理对细菌多样性的影响不显著(P>0.05)。有机肥M3处理下,细菌多样性Shannon 指数最大,为8.37,硫酸亚铁F2(100 g/m2)处理下细菌Shannon指数下降3.54%。

2.2.2 不同施肥处理对真菌丰富度及多样性的影响 由图3可知,有机肥、硫酸亚铁处理对真菌OTUs的影响不显著(P>0.05),互作处理对真菌OTUs的影响极显著(P<0.01)。互作处理除M0F2、M1F0、M2F1 外,其他处理下真菌OTUs显著增加,其中M3F0 处理下真菌OTUs最大,增幅度57.26%;互作处理对真菌丰富度(Chao1)的影响极显著(P<0.01),M1F2、M2F0、M3F0处理下真菌丰富度增加,增长率分别为51.06%、37.19%、46.96%;硫酸亚铁处理对真菌多样性(Shannon指数)的影响显著(P<0.05),F2处理下真菌多样性显著高于F1,但与空白组对照,F1和F2未发生显著变化。

图3 不同施肥处理真菌特征Fig.3 Fungal characteristics under different fertilization treatments

2.3 细菌和真菌恢复状况

图4结果显示,细菌Chao1指数和Shannon指数在有机肥,硫酸亚铁及交互处理下得到不同程度的恢复,与自然山体相比差异不显著(P>0.05)。不同施肥处理下真菌Chao1 指数和Shannon 指数与周边自然山体差异显著(P<0.05)。总之,施用有机肥对渣山表土细菌数量和多样性具显著影响,有利于细菌群落的恢复。

图4 细菌和真菌恢复状况Fig.4 Recovery of bacteria and fungi under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理下细菌及真菌群落结构组成

2.4.1 不同施肥处理下细菌门和属水平下的群落结构组成 对细菌门分类水平下相对丰度>1%,排名前5的优势种,如放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)进行统计分析(除去其他和未分类)。如表1结果显示,变形菌门和拟杆菌门在有机肥处理下相对丰度显著增加(P<0.05),M3处理下两者分别是M0的1.1倍、2.1倍,而放线菌门和芽单胞菌门相对丰度在有机肥处理下显著降低(P<0.05),与M0相比,两者分别下降10.52%～19.65%、48.45%～50.77%。硫酸亚铁处理下,当施肥量为100 g/m2时,放线菌门相对丰度达到41.88%,比F0高出9.74%。有机肥和硫酸亚铁交互处理对拟杆菌门相对丰度影响显著(P<0.05),M3F1、M2F0处理下,拟杆菌门相对丰度达9.81%、8.71%,是 M0F0(3.9%)的2.5倍、2.2倍。

表1 细菌门水平相对丰度分析Table 1 Analysis of relative abundance of bacteria at phylum leve %

对细菌属分类水平下相对丰度>1%,排名前5的优势种假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、类诺卡氏属(Nocardioides)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、农杆菌属(Pedobacter)及芽单胞菌属(Gemmatimonas)进行统计分析(除去其他和未分类)。结果如表2所示,有机肥处理下,假节杆菌属、农杆菌属、鞘脂单胞菌属及芽单胞菌属相对丰度发生显著变化,假节杆菌属相对丰度在M1处理下达到最大值,为8.65%,农杆菌属相对丰度在有机肥M2处理下是M0的2.8倍,鞘脂单胞菌属相对丰度在M3处理下显著下降13.17%,芽单胞菌属相对丰度在M2 处理下显著下降45.55%。硫酸亚铁处理下,假节杆菌属相对丰度发生显著变化,硫酸亚铁施肥量为100 g/m2时,假节杆菌属相对丰度达到8.56%。有机肥和硫酸亚铁交互处理对鞘脂单胞菌属和农杆菌属相对丰度影响显著,鞘脂单胞菌属相对丰度在M3F1处理下相对丰度最低,比M0F0低33.70%,而农杆菌属相对丰度在M2F2及M3F1处理下分别达到3.45%、3.22%,是M0F0的3.9倍、3.6倍。

表2 细菌属水平相对丰度分析Table 2 Analysis of relative abundance of bacteria at genus level %

2.4.2 不同施肥处理下真菌门和属水平下的群落结构组成 对真菌门分类水平下相对丰度>1%,排名前5的子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、鞭毛菌门(Mortierellomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和油壶菌门(Olpidiomycota)进行统计分析(除去其他和未分类)。表3结果显示,有机肥处理下子囊菌门相对丰度显著增加(P<0.05),担子菌门相对丰度显著降低(P<0.05),随着有机肥施肥量增加,子囊菌门相对丰度增加9.86%～14.96%、担子菌门相对丰度减少51.92%～72.34%。硫酸亚铁处理和交互处理对子囊菌门、担子菌门、鞭毛菌门、壶菌门和油壶菌门相对丰度无显著影响(P>0.05)。

表3 真菌门水平相对丰度分析Table 3 Analysis of relative abundance of fungi at phylum level %

对真菌属分类水平下相对丰度>1%,排名前5的优势种微囊菌属(Microascus)、赤霉属(Gibberella)、附球霉属(Epicoccum)、小幽线孢属(Monographella)及青霉属(Penicillium)进行统计分析(除去其他和未分类)。表4结果显示,有机肥处理对微囊菌属、附球霉属及青霉属相对丰度产生显著影响(P<0.05),微囊菌属相对丰度在M3处理下是M0的44倍,附球霉属和青霉属相对丰度在M2 处理下最小,比M0 分别降低76.83%、72.40%。硫酸亚铁处理下,赤霉属和附球霉属相对丰度发生显著变化(P<0.05),赤霉属相对丰度在F2 处理下达到最大值,为13.34%,与F0相比,增长率可达66.75%,附球霉属相对丰度在F1 处理下达到最大值 ,为14.23%,是F0的2.8倍。有机肥和硫酸亚铁交互处理下微囊菌属、小幽线孢属相对丰度发生显著变化(P<0.05),M3F0、M3F1处理下微囊菌属相对丰度高达45.81%、43.01%,分别是M0F0的57.9倍、54.4倍,而M1F0处理下小幽线孢属相对丰度高达14.09%,是M0F0的3.5倍。

表4 真菌属水平相对丰度分析Table 4 Analysis of relative abundance of fungi at genus level %

2.5 不同施肥处理渣山土壤细菌、真菌NMDS

NMDS(Nonmetric multidimensional scaling)分析,即非线性多维标度分析,可用于比较多个样本间的差异。图5结果显示,硫酸亚铁处理M0F2 、M0F1 和 M0F0 都 位 于 NMDS1 和NMDS2正端,样本相似性极高,这说明硫酸亚铁对土壤细菌影响不大;M1F2、M3F2、M1F1、M2F1、M2F2、M2F0、M3F1、M3F0 都 位 于NMDS1正端、NMDS2负端,样本之间存在极大的相似性;ZRST(自然山体)与 M1F0 处于NMDS1负端和NMDS2 负端,这表明M1F0 与自然山体群落OTUs相似,其余处理下的渣山土壤细菌生长特征与自然山体之间仍存在较大差异。

图5 不同施肥处理下渣山土壤细菌群落NMDSFig.5 NMDS of soil bacteria community in residue mountain under different fertilization treatments

图6 所 示,M0F0、M0F2 、M0F1、M1F0、M2F2等处理位于NMDS1 和NMDS2 正端,样本 相 似 性 极 高;M1F2、M1F1、M2F1、M3F2、M3F1、M2F0、M3F0 都 位 于 NMDS1 正 端、NMDS2负端,样本之间存在极大的相似性;ZRST(自然山体)单独处于NMDS1 负端和NMDS2负端,这表明试验处理下的渣山土壤真菌生长特征与自然山体之间仍存在差异。

图6 不同施肥处理下渣山土壤真菌群落NMDSFig.6 NMDS of soil fungal community in residue mountain under different fertilization treatments

2.6 微生物特征与植被生长特征的关系

表5结果显示,植被高度与细菌Shannon呈极显著正相关关系(P<0.01)。植被盖度与细菌OTUs、真菌OTUs均呈显著正相关关系(P<0.05),与细菌Shannon 呈极显著正相关关系(P<0.01)。植被地上生物量与真菌OTUs呈显著正相关关系(P<0.05),其余各微生物特征与植被生长特征不相关(P>0.05)。

表5 渣山土壤微生物Alphy多样性与植被特征的关系Table 5 Relationship between soil microbial alphy diversity and vegetation characteristics in coalmine field

使用试验数据做DCA 分析(Detrended correspondence analysis),结果中第一轴Lengths of gradient为0.17,小于3.0,故选择RDA 分析。如图7所示,RDA 结果反映了环境因子对植被生长的影响,第1轴和第2轴分别解释植被生长的33.32% 和38.21%,结合表6 结果分析,细菌Shannon指数与植被生长呈极显著正相关关系(P<0.01),解释率达到22.7%。细菌Chao1指数、细菌OTUs、真菌Shannon指数、真菌Chao1指数与植被生长指标之间不存在显著相关性(P>0.05)。

图7 不同施肥处理下植被特征与微生物多样性RDA冗余分析Fig.7 RDA redundancy analysis of vegetation characteristics and microbial diversity under different fertilization treatments

表6 微生物指标对植被生长的贡献率Table 6 Contribution rate of microbial indicatorsto vegetation growth

3 讨论

3.1 不同施肥处理对植被生长的影响

硫酸亚铁可调控土壤p H[11],土壤p H 则通过影响土壤溶液中有效离子的浓度来影响植被生长[12],有机肥中含丰富的有机质[13],可为植被生长提供养分[14]。本次试验结果显示,硫酸亚铁及其与有机肥互作处理对改善植被生长状况效果不显著,而单施有机肥处理对植被高度、盖度、地上生物量均有显著影响,说明土壤有机质是影响植被生长的关键因素。渣山土壤贫瘠,保水保肥力差,仅仅通过改变土壤p H 对植被生长的影响不明显,这与苗菁等[15]研究结论一致,因此,及时补充土壤营养是促进渣山植被生长的关键。本次试验结果显示有机肥施肥量为3 kg/m2时牧草生长状况相对较好,这种有机肥施肥量是非矿区最适有机肥施肥量的13倍。

3.2 不同施肥处理对细菌和真菌丰富度及多样性的影响

p H 是影响土壤微生物群落的主要因素[16-17],有机肥能使土壤中的养分含量显著提高,有利于土壤微生物的恢复[18],在矿区生态恢复中应用较多[19]。

Chao1指数代表微生物群落丰富度,指数越高说明群落物种越丰富。本研究结果表明,有机肥、硫酸亚铁、有机肥与硫酸亚铁的互作处理均能显著提高土壤细菌丰富度,土壤真菌丰富度只受有机肥与硫酸亚铁互作的影响,这说明细菌丰富度的提高主要取决于营养物质的补充,真菌丰富度的提高需要营养物质补充和土壤p H 调节的共同作用。有机肥处理对细菌丰富度影响分析中发现,有机肥施肥量增加到1 kg/m2时,细菌丰富度达到显著水平,有机肥施肥量增加到2 kg/m2、3 kg/m2时,细菌丰富度的升高不明显,这可能是因为研究区气温较低,对有机肥的分解具有一定的限制作用[20]。

Shannon指数反映土壤微生物群落多样性,指数越高说明群落物种数量越多。本研究结果表明,随着有机肥量的增加,细菌物种数量逐渐增加,真菌物种数量基本不变,这可能是因为土壤有机质含量越高,土壤细菌结构越复杂[21],而真菌喜欢低水分与低养分的土壤环境[22];硫酸亚铁及其与有机肥的互作对细菌与真菌物种数增加影响不显著,这说明加入硫酸亚铁后,土壤p H 发生改变,限制了细菌对有机肥的利用。

3.3 不同施肥处理下矿区土壤微生物群落结构特征

本试验研究结果中,放线菌门在有机肥处理下相对丰度显著降低,与徐忠山等[23]的研究一致;拟杆菌门相对丰度在有机肥处理下相对丰度显著提高,硫酸亚铁处理下变化不显著,交互处理下除M0F1、M0F2 处理外,其余处理下显著增加,这说明拟杆菌门对土壤营养要求较高,不受p H 影响;芽单胞菌门在有机肥处理下相对丰度显著降低,这与陈金旭[24]研究结果一致,硫酸亚铁及交互处理对其影响不大,这可能是p H 限制了有机质的分解;鞘脂单胞菌属在有机肥施肥量>2 kg/m2时相对丰度显著降低,硫酸亚铁下变化不显著,在有机肥、硫酸亚铁交互处理下显著降低,这说明有机肥可限制鞘脂单胞菌属生长。

子囊菌门在有机肥处理下相对丰度显著提高,这是因为子囊菌门具有溶解土壤可溶性有机底物的作用[25],而有机肥能提高土壤有机质含量,故子囊菌门相对丰度增加。担子菌门在有机肥处理下相对丰度显著降低,这与柴小粉等[26]在果园施用有机肥得到结论一致。微囊菌属在有机肥处理及交互处理下相对丰度显著提高,硫酸亚铁对其丰度影响不显著,这说明微囊菌属的生长繁殖主要依赖于有机质,单施硫酸亚铁对其影响不大。赤霉属在硫酸亚铁处理下显著提高,有机肥处理及交互处理下其相对丰度未发生变化,这是因为赤霉属生长受限于土壤p H,土壤营养物质对其影响不大。附球霉属在3 kg/m2有机肥,100 g/m2硫酸亚铁处理下丰度显著降低,这说明附球霉属适应于未作处理前低养分、弱碱性环境。青霉属在有机肥处理下显著降低,这说明青霉属适应于低养分环境。

3.4 土壤细菌和真菌特征与植被生长特征的相关性

微生物通过释放难溶性矿物质营养元素,与植物根系形成菌根增加植物抗逆性等途径来促进植被生长[27]。李飞[28]在高寒退化草甸研究中发现细菌Shannon指数和真菌Shannon指数与植被盖度之间存在显著负相关关系,细菌Chao1指数与植被地上生物量和高度存在显著正相关关系,与本次研究结果存在差异,可能是不同土壤类型及植被类型下土壤微生物生境不同造成的。预示着高寒矿区渣山植被的生态恢复需要较长时间,本试验由于植被恢复时间短,土壤微生物特征变化还需要后续持续观测。

4 结论

有机肥(M3)处理能促进植被生长,提高细菌Chao1指数和Shannon指数。与自然山体相比,矿区重构土壤细菌丰富度和多样性在不同处理下均得到恢复。有机肥处理可显著提高细菌拟杆菌门、假节杆菌属及农杆菌属,真菌子囊菌门和微囊菌属相对丰度;硫酸亚铁处理可显著提高细菌放线菌门、假节杆菌属,真菌赤霉属和附球霉属相对丰度;交互处理可显著提高拟杆菌门和农杆菌属,真菌微囊菌属相对丰度。Beta多样性分析显示,M1F0试验处理下细菌OTUs与自然山体相似。细菌Shannon指数对植被生长影响显著。综上所述,短期内有机肥有利于植被生长和土壤细菌恢复。