乳腺癌细胞外泌体激活肝星状细胞转变为肿瘤相关成纤维细胞

张思瑾，肖嘉懿，李彩娟

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，对女性的健康及生命安全构成严重威胁。根据世界卫生组织国际癌症研究机构的最新数据显示，乳腺癌已经超过肺癌成为全球第一大癌症[1]。肝脏是乳腺癌转移的第三常见部位，占转移性乳腺癌的8%～14%。肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)在肿瘤的转移中发挥着重要的作用，而微环境中的主要成分为成纤维细胞如我们研究的肝星状细胞。在乳腺癌发生肝转移的过程中有一种发挥重要作用的载体叫做外泌体(Exosomes)，外泌体是一种由活细胞分泌的直径为30～200 nm的细胞外囊泡，其内含有细胞特异的DNA、RNA及蛋白质等生物活性物质，广泛的参与血管再生、细胞迁移及肿瘤的发生发展过程[2]。我们旨在探究乳腺癌细胞外泌体对肝脏基质微环境中肝星状细胞的影响，为进一步研究乳腺癌肝转移的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料本实验所用的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人肝星状细胞(Hepatic stellate,HSC)细胞株LX2均从中国科学院上海生命科学研究院的细胞库购买。高糖DMEM培养基及PBS来自中国的meilunbio公司。胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)来自澳大利亚的AusGeneX公司。去外泌体的FBS购自澳大利亚的Gibco公司。外泌体表面标志蛋白CD63、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)、内参蛋白β-actin均购自美国Abcam公司。荧光染料PKH67购自美国的Sigma公司。荧光染料DAPI来自中国的碧云天公司。超高速离心机及超高速离心管均购自美国的Beckman公司。透射电子显微镜购自美国FEI公司。电泳仪及相应转膜装置均购自美国的Bio-Rad公司。活细胞荧光显微镜来自德国的Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞株MDA-MB-231和LX2的常规培养均用含1%双抗、10%FBS的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱内进行培养。当细胞密度超过80%时可以进行细胞的传代或冻存。在提取外泌体时，培养液中的FBS需要换成无外泌体的FBS。

1.2.2 外泌体提取与纯化 采用超速差速离心法进行外泌体提取，收集细胞上清于离心管中，首先300 ×g离心10 min，去除细胞沉淀，随后2000 ×g离心10 min去除细胞碎片，10000 ×g离心30 min，接着用0.22 μm滤器过滤，100000 ×g离心2 h，收集沉淀并用无菌PBS重悬，最后100000 ×g离心2 h，进行外泌体纯化，均在4 ℃条件下进行离心，重悬后外泌体置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 透射电子显微镜观察外泌体 滴样品200 μL于封口膜上，把200目铜网的芳华膜面置于样品上，10 min后竖起铜网用无菌滤纸吸干。滴负染液200 μL于封口膜上，把吸附完样品的铜网膜面置于液体上1 min，竖起铜网用无菌滤纸吸干。膜面向上方于铺满滤纸的干燥玻璃皿内，红外灯下10 min烤干。置于透射电子显微镜观察外泌体的形态及大小。

1.2.4 粒径分析 通过Nano Measurer软件进行粒径分析，分析外泌体粒径的分布范围。

1.2.5 蛋白印迹分析 提取乳腺癌细胞外泌体总蛋白，按RIPA∶PMSF=1∶100的比例进行裂解液的配置，加入200 μL裂解液，冰上裂解30 min，期间每5 min吹打一次。移至1.5 mL EP管中，在4 ℃环境下，12000 r离心10 min。吸取上清液至预冷干净的1.5 mL EP管中并做好标记。加入适量5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min。根据目的蛋白分子量大小配置SDS-PAGE凝胶，然后上样，电泳80 V 30 min在转到120 V 40 min，转膜180 mA 65 min。接着用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗3次，每次10 min。加入一抗，4 ℃环境下摇床孵育过夜。结束后TBST洗3次，每次10 min。加入二抗室温室温摇床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。配置显色液(AB液各200 μL)进行曝光显影。

1.2.6 摄取实验 取对数生长期的LX2细胞，铺于6孔板，在37 ℃ CO2培养箱中培养24 h，24 h后去除旧培养液，PBS洗3次。取外泌体-PBS悬液，加入PKH67荧光染料，染色4 min后加入等体积的无外泌体 FBS结合多余染料来终止染色。将染色后的外泌体加入LX2细胞培养液中，在37 ℃ CO2培养箱中孵育5 h后，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗3次。在孔板中加入DAPI染料染色10 min，用PBS洗3次。在载玻片上滴少量封片液，封片后进行拍照。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞外泌体的分离与鉴定我们观察到外泌体为圆形或类圆形的双层膜性囊泡状结构，如图1所示。粒径分布比较集中，主要分布在30～200 nm范围内，如图2。并且能够表达外泌体标志蛋白CD63，如图3。综上结果显示，我们通过超速差速离心法提得的细胞外囊泡为外泌体。

图1 乳腺癌细胞外泌体粒径分析，标尺为100nm

图2 乳腺癌细胞外泌体电镜图范围

图3 外泌体标志蛋白CD63表达

2.2 乳腺癌细胞外泌体被LX2摄取我们观察到PKH67荧光标记的外泌体为绿色(图4A)，DAPI标记的细胞核为蓝色(图4B)，经过共孵育后外泌体进入LX2紧贴细胞核(图4C)，说明乳腺癌细胞外泌体可以被LX2摄取。

图4 PKH67标记的外泌体(绿色)能被DAPI标记的LX2(蓝色)摄取

2.3 乳腺癌细胞外泌体激活LX2我们发现，经乳腺癌细胞外泌体处理的LX2(Exosomes组)与未经外泌体处理的LX2(Control组)相比，α-SMA的表达水平显著增高，如图5所示。结果表明，乳腺癌细胞外泌体可以激活LX2为肿瘤相关成纤维细胞。

图5 乳腺癌细胞外泌体与LX2共孵育后，α-SMA的表达

3 讨论

TME主要由促瘤成分如肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)、肿瘤血管、M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)、辅助性T细胞-2(T helper-2,Th2)细胞因子及抑瘤成分构成。CAFs是一种重要的基质细胞，在应激、炎症、癌细胞等刺激下被激活成为一种肌成纤维细胞，标志为表达α-SMA及成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)等[3]。现已证实TME在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程中发挥了重要作用[4]。例如，Yan等[5]发现乳腺癌细胞外泌体中的miR-105可以激活CAFs中的MYC基因信号，使CAFs的特征能根据微环境中的代谢变化来做出改变。然而，关于肿瘤细胞外泌体对远处预转移器官基质细胞作用的研究甚少，尤其是在乳腺癌肝转移方面。我们的实验在体外证实高转移性乳腺癌细胞外泌体能够诱导肝成纤维细胞发生与肿瘤相关的改变，即转化为CAFs表型，使其有利于支持肿瘤细胞的生长。

外泌体粒径介于30～200 nm之间，具有脂质双层膜的细胞外囊泡结构，沉降离心力为100000 g，膜上标志蛋白为CD63、CD9、CD81等。外泌体广泛分布在外周血液、唾液、尿液及其他体液中[6]，许多细胞都能分泌外泌体[7]，外泌体能参与肿瘤的发生、发展、转移、侵袭等多种病理生理过程[8]。外泌体作为细胞之间的通讯工具，可以使远处待转移部位发生一系列变化，如高转移性肝癌细胞外泌体miR-1247-3p通过靶向 B4GALT3使β1-整合素-NF-κB 信号通路激活，促进肺成纤维细胞分泌促炎因子来塑造炎症微环境，进而促进肝癌发生肺转移[9]。此外，外泌体是微环境成分之间相互作用的重要载体，阻断外泌体的通讯已被视为潜在的肿瘤治疗靶点，例如减少外泌体的生物合成及释放、减少受体细胞对外泌体的摄取及减少血浆中外泌体的数量等。Peng等[10]发现，上调miR-34c-5p可以减少急性髓系的外泌体生成，并可通过诱导衰老促进急性髓系肿瘤细胞的清除。

LX2在正常生理状态下表现为静息状态，当受到多种外界因素干扰时转化为活化状态[11]。活化的LX2会导致细胞外基质和胶原蛋白沉积物增多，这与肿瘤细胞肝转移的发生及发展存在密切的联系[12-13]。而静息状态下的LX2在炎症或损伤信号等因素的刺激下定向转化为肌成纤维细胞，这会使细胞的增殖和收缩能力增强，在分子层面上表现为α-SMA、FAP及胞膜受体表达增多等。另一方面，活化的LX2所分泌的细胞因子可以为肿瘤细胞的生长提供良好的TME，进一步促进肿瘤细胞的侵袭及转移[14]。近年来，研究者们发现，不仅慢性肝脏炎症因子、细胞因子和活性氧可激活LX2，细胞外囊泡、微小RNA、长链非编码RNA等也进行了参与，其中就包括外泌体。例如李飞飞[15]发现，结直肠癌细胞外泌体能够被LX2摄取并将LX2转化为肌成纤维细胞。

我们通过超速差速离心法提取了乳腺癌MDA-MB-231细胞外泌体，并通过透射电子显微镜、Nano Measurer软件和蛋白免疫印迹实验对提得的外泌体进行鉴定分析。发现外泌体呈圆形或类圆形的双层膜样囊泡，粒径大部分分布在30～200 nm之间，符合外泌体的形态、粒径特征，并通过WB实验检测了外泌体表面标志蛋白CD63的表达，进一步证明我们提取的是外泌体。通过摄取实验发现，乳腺癌细胞外泌体可以被LX2摄取，表明外泌体内的成分可以转移到LX2内，进一步发挥生物学作用。有研究表明，LX2在体外培养7～10 d时会自动活化，我们将其设置为对照组；将乳腺癌细胞外泌体与LX2共孵育后设置为实验组，在48 h后提取LX2蛋白进行WB实验，我们发现与对照组相比，实验组α-SMA的表达明显升高，说明LX2在外泌体的作用下，被激活成CAFs。综上所述，高侵袭性乳腺癌细胞外泌体可以被LX2摄取并激活LX2转变为CAFs。

通过我们的研究可以引申出这样一个问题，即具体是外泌体中的何种成分导致了肝肌成纤维细胞的活化，活化后的CAFs又是通过何种机制去作用于周边基质微环境的。接下来我们将检测乳腺癌细胞外泌体中高表达的miRNA，通过生物学软件预测其靶基因，通过实验来证实其对CAFs活化的调控作用。

综上所述，本研究为进一步研究乳腺癌细胞外泌体活化肝肌成纤维细胞为CAFs的机制提供了基础，也为研究CAFs如何影响乳腺癌的转移提供了参考，有望为乳腺癌肝转移的早期诊断及治疗提供新思路。