主动饮酒对中脑腹侧被盖区GABA神经元形态学特征的影响

王琦玉，张洪艳，王 雪，徐璐璐，熊君伟，关艳中

(牡丹江医学院生理学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

酒精使用障碍(Alcohol use disorder,AUD)是一种慢性疾病。患者表现出强迫性饮酒，不饮酒时表现出消极的情绪[1-2]。突触可塑性是中枢神经系统学习和记忆的基础[3-4]。它可以通过增加或降低突触强度来处理和存储信息。课题组发现，暴露于酒精会阻断大鼠VTA多巴胺神经元上GABAA受体介导的突触传递的长时程增强[5](Long-term potentiation of GABAergic synapses,LTPGABA)。但酒精对GABA神经元形态学产生的影响尚未阐明。Li[6]等人在之前的研究中发现，大鼠在戒断后72 h的酒精摄入量明显高于戒断0 h组。因此把戒断72 h作为一个时间点，在以下实验中分别进行探究。研究主动饮酒对VTA GABA的神经元形态学的影响，可以为AUD的临床预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180～200 g，购自牡丹江医学院动物实验中心，实验动物生产许可证号:SYKX(黑)2019-006。所有动物被单独饲养在通风的有机玻璃笼中，在受控的灯照(12 h光照和12 h黑暗)，温度20～25 ℃，接受过滤水和动物食品。所有程序均通过《国家实验室动物护理和使用卫生指南》和牡丹江医学院动物护理和使用委员会的指南批准。

1.1.2 实验试剂 5%水合氯醛，无水乙醇，4%多聚甲醛，蔗糖(≥99.5%，BioReagent)，樱花冷冻包埋剂(OCT)，丙酮，免疫染色通透液(triton x-100)，PBS缓冲液(干粉)，BSA，Anti-GAD67，抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗，DAPI，抗荧光淬灭封片液，2.5%戊二醛固定液，二甲胂酸钠缓冲液，1%四氧化锇，812环氧树脂，2%醋酸双氧铀，枸橼酸铅。

1.1.3 实验仪器 酶标仪(M3，国Molecular Devices 公司)，激光共聚焦显微镜(Fv1000，奥林帕斯)，透射电镜(2100 plus，日本日立)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型的建立 大鼠按体重随机分为对照组和饮酒组。饮酒组大鼠在第1天上午8点，接受两瓶液体，分别是100 mL 20%的酒精和100 mL水。在饮用水和酒精24 h之后，记录大鼠的液体摄入量，置换酒瓶放入一瓶水，此时饮酒组大鼠饮用两瓶水(戒断期)，24 h之后置换出两个水瓶，放入100 mL 20%的酒精和100 mL水，酒瓶与水瓶的位置与第1天相反，以控制侧边偏好，以此模式循环4周，饮酒量达到3.2 g/(kg·24 h)为酒精成瘾大鼠。对照组大鼠自由饮用两瓶水。每周对大鼠的体重进行测量。

1.2.2 免疫荧光测定大鼠VTA GABA神经元 将30只雄性SD大鼠，按体重随机分为对照组(n=10)，饮酒组(n=20)。按上述方法建立模型，将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。使用水合氯醛(0.7 mL/100g)将大鼠麻醉，解剖后经心脏左心室灌注生理盐水(100～150 mL)，取脑组织于4%的多聚甲醛中固定1 h，30%蔗糖脱水。分离VTA组织(bregma-4.30～bregma-6.30 mm)，OCT胶包埋，冰冻切片5 μm，4 ℃丙酮固定，PBS洗涤(5 min×3)，tritonX-100通透后PBS洗涤(5 min×3)，5%BSA封闭1 h，吸去血清，加一抗(Anti-GAD67)，4 ℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤(5 min×3)，荧光二抗[抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗]暗处30 min，PBS洗3次，DAPI染色10 min，PBS洗3次，封片使用激光共聚焦显微镜观察。每个样本选取3张切片观察，随机选取5个视野拍片、计数，取平均数。

1.2.3 Elisa测定大鼠VTA谷氨酸脱羧酶(GAD) 选取35只雄性SD大鼠，按体重随机分为对照组(n=10)和饮酒组(n=25)。建立模型后，将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。脑组织匀浆离心取上清液。设置标准品孔，对照孔，样品孔。依次加入样品，酶标试剂。封板37 ℃温育1 h，洗涤5次后拍干。加入显色剂、37 ℃避光显色1 min，加入终止液，测吸光度。

1.2.4 大鼠VTA神经元超微结构的观察 选取20只雄性SD大鼠，随机分为对照组(n=6)和饮酒组(n=14)。建立模型后，将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。取脑组织，大小为1 mm3，用2.5%戊二醛和二甲胂酸钠缓冲液固定；用1%四氧化锇(OsO4)后固定，脱水；环氧树脂浸润。超薄切片70 nm在网格上用2%醋酸双氧铀和枸橼酸铅进行染色，酒精脱水。每个实验组的标本在3个不同视野中观察。

1.3 统计学处理计量数据以“均数±标准差”表示，采用GraphPad Prism 7作图，不同组间使用Dunnet-t和t检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 酒精对大鼠VTA GABA神经元数量的影响与对照组(135.90±9.92)个/mm2相比，戒断0 h组GABA神经元计数(77.88±9.33)个/mm2和戒断72 h组GABA神经元计数(78.63±9.50)个/mm2均明显降低，具有统计差异(F2,23=110.7，P<0.01)。戒断0 h组和戒断72 h组相比，无统计差异(t=0.16，P>0.05)，见图1。

图1 SD大鼠VTA GABA神经元激光共聚焦图像(×400，比例尺=50 μm)

2.2 酒精对大鼠VTA大鼠谷氨酸脱羧酶(GAD)的影响与对照组(46.92±3.27)ng/mL相比，戒断0 h组的GAD含量(32.21±4.79)ng/mL和戒断72 h组GAD含量(33.04±2.79)ng/mL均明显降低，具有统计差异(F2,27=49.45，P<0.01)。戒断0 h组和戒断72 h组相比，无统计差异(t=0.47，P>0.05)。

2.3 酒精对大鼠VTA神经元超微结构的影响对照组线粒体结构正常，神经纤维髓鞘结构完整；戒断0 h组与戒断72 h组神经元内线粒体肿胀变性、嵴断裂，神经纤维髓鞘结构松懈，密度降低，见图2。

图2 VTA神经元超微结构(28000)

注：A、B、C为神经元髓鞘；D、E、F为胞质内线粒体

3 讨论

γ-氨基丁酸(GABA)能神经突触活动与AUD的形成和发展关系密切，包括奖赏、戒断和复发等。突触可塑性，即神经元之间突触传递发生增强或减弱的改变。研究发现突触可塑性在AUD中发挥重要作用[7]。突触传递长时间增强的状态称为LTP。本实验室发现暴露于酒精会阻断大鼠VTA多巴胺神经元上GABAA受体介导的突触传递的长期增强(LTPGABA)，本实验发现主动饮酒减少VTA GABA神经元的数量。Smile等也发现，酒精会降低GABA神经元数量[8]。他们检测了出生后第7天酒精处理后成年小鼠皮层体积、厚度和细胞组织的变化，发现脑体积在酒精处理下减少10～13%，大脑皮层表现出相似的减少，神经元总数下降幅度约为8%，GABA神经元数量显著减少30%。在C57BL/6和BALB/cJ小鼠品系中也发现了类似的酒精效应。

GABA是控制突触兴奋、抑制所需的抑制性神经递质，它由GAD合成[9-11]。GAD为GABA神经元的特异性标记酶，它的表达和活性与GABA水平以及抑制突触的GABA能神经传递高度相关。我们的研究结果显示酒精会降低VTA GAD表达，提示主动饮酒可能抑制VTA GABA合成。但Lee S E[12]等人发现，急性和短期酒精使大鼠脑各区域GAD活性升高。这种差异可能是不同脑区对酒精的反应不同造成的。

本实验进一步观察了VTA神经元的超微结构。结果显示，对照组线粒体结构正常，神经纤维髓鞘结构完整；戒断0 h组与戒断72 h组神经元内线粒体肿胀变性、嵴断裂，神经纤维髓鞘结构松懈，密度降低。Cui Z J[13]等人发现，在饮酒的动物中，突触的超微结构发生了显著变化。突触间隙的宽度明显减少，并伴有突触后膜增厚，突触囊泡数量减少。Skuja S等人[14]对酒精使用者前额叶皮质、纹状体和黑质进行研究，发现神经元轴突末梢不肿大或轻微肿大，并含有大量突触囊泡，突触前和突触后膜增厚，轴突末梢包含有规则形状的线粒体，嵴变窄且略弯曲等，轴突呈不规则形状，包括肾形，线粒体呈不同程度的管状嵴扩张。树突表现为明显肿胀，微管很少，体积增大，线粒体肿胀，嵴缩小。这与我们的研究结果相一致，表明酒精可以损害神经元超微结构。

综上所述，主动饮酒会降低GABA神经元数量，损害GABA神经元的超微结构，对酒精成瘾中枢机制探索和临床防治提供了科学资料。