槐定碱对肺腺癌细胞A549顺铂敏感性及miR-216a-5p/ZEB1轴的影响

聂佳， 李方， 李延波

（1.河北省中医院呼吸内科，河北石家庄 050000；2.邯郸市中心医院肿瘤科，河北邯郸 056000；3.邢台市信都区人民医院普通内科，河北邢台 054001）

肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，非小细胞肺癌占85%以上，主要包括腺癌、鳞状细胞癌等。目前，临床主要通过手术、放化疗等多种手段治疗，但患者总体生存率仍较低[1]。肿瘤细胞对抗癌药物不敏感或容易产生耐药是肿瘤化疗效果不佳的原因[2]。提高化疗敏感性，对于改善NSCLC患者生存质量、延长生存期、降低死亡率具有重要意义。中医药在治疗肺癌方面具有潜在优势，对放化疗及分子靶向治疗具有一定的增效作用，可不同程度地影响患者预后[3-5]。苦豆子为豆科植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.的种子，具有清热燥湿、止痛杀虫等功效，槐定碱（sophoridine）是苦豆子中含量较高的生物碱之一，有抗病毒、调节免疫功能、抗心律失常、抗肿瘤等[6-11]多种药理学作用。本研究以肺腺癌A549细胞为研究对象，观察槐定碱对A549 细胞化疗敏感性的影响，并探讨其可能的作用机制，为槐定碱相关药物开发应用于临床抗肿瘤治疗提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系人肺腺癌A549 细胞株，购自中国科学院上海细胞中心。

1.2 药物、试剂与仪器槐定碱（分子式：C15H24N2O；分子量：248.36），纯度≥96.5%，成都曼斯特生物科技有限公司生产，批号：A0651；顺铂（cisplatin，合肥千盛生物科技有限公司生产，批号：200822）。RPMI-1640 培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；抑制剂（miR-216a-5p inhibitor）、抑制剂阴性对照（inhibitor-NC）、miR-216a-5p 拟似物（miR-216a-5p mimic）、拟似物阴性对照（mimic-NC）（广州锐博生物科技有限公司生产）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；兔抗人锌指E 盒结合蛋白1（ZEB1）、B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）等抗体及山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）-辣根过氧化物酶（HRP）（英国Abcam 公司）。ELX800 全自动酶标仪（美国Biotek 公司）；实时荧光定量PCR 仪（美国Thermofisher 公司）；FACSCalibu 流式细胞仪系统（美国BD公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 细胞培养A549细胞常规复苏后，接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基（100 U/mL 青霉素+100 mg/L 链霉素）中，5%CO2、37 ℃条件下培养，待细胞贴壁80%时进行传代，每2 ～3 d 传代1次，选取对数期细胞用于实验。

1.4 槐定碱对A549细胞顺铂敏感性的影响

1.4.1 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度槐定碱、顺铂处理后的细胞增殖能力 取对数生长期A549 细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为1×105/mL，接种于96孔板，24 h后吸去培养基，加入含有不同浓度槐定碱（10、20、40、80、160 μmol/L）、顺铂（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 nmol/L）的培养基，每个浓度设5 个复孔，同时设空白组（不加药物）。24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续孵育4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，充分振荡10 min，酶标仪测定570 nm 波长处吸光度（OD）值。计算不同浓度槐定碱、顺铂干预后的细胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-不同浓度药物组OD值/空白组OD值）×100%。根据结果，选取接近于20%抑制浓度（20% inhibitory concentration，IC20）的槐定碱和顺铂浓度进行后续实验。

1.4.2 细胞分组与干预 取对数期A549 细胞，随机分为对照组、槐定碱组、顺铂组和槐定碱+顺铂组。对照组常规培养；槐定碱组和顺铂组根据“1.4.1”项筛选的药物浓度，分别加入40 μmol/L的槐定碱和2.0 nmol/L 的顺铂；槐定碱+顺铂组同时加入上述浓度的槐定碱和顺铂。继续培养24 h。

1.4.3 平板克隆实验检测集落形成能力 取“1.4.2”项中各组细胞，调整细胞浓度为1×105/mL接种于6孔板，水平位置轻晃培养板，使细胞均匀分布，置于5%CO2、37 ℃条件下培养。每3 d更换一次培养基。2 周后，吸去培养基，PBS 清洗，每孔中加入200 μL 结晶紫，染色20 min，冲洗晾干，观察集落数。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集“1.4.2”项中各组细胞，1000 r/min（离心半径8 cm）离心5 min，弃上清，将细胞吹打均匀，制备单细胞悬液，再次离心，加入400 μL 结合缓冲液重悬细胞。加入5 μL Annexin-FITC 混匀，避光室温孵育15 min，加入10 μL PI，4 ℃避光孵育5 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算：细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5 槐定碱对A549细胞miR-216a-5p/ZEB1 轴的影响

1.5.1 细胞转染与分组 取对数期A549 细胞，进行转染。细胞转染前1 d，调整密度为1 ×106/mL，接种于6孔板，待细胞融合达80%时，胰酶消化，收集细胞。随机分为对照（control）组，抑制剂阴性对照（inhibitor-NC）组、抑制剂（inhibitor）组、槐定碱组、槐定碱+inhibitor-NC组、槐定碱+inhibitor组。control组常规培养，使用LipofectamineTM2000， 将miR- 216a- 5p inhibitor- NC 转 染 至inhibitor-NC组和槐定碱+inhibitor-NC组细胞，将miR-216a-5p inhibitor转染至inhibitor组和槐定碱+inhibitor组细胞，24 h 后，槐定碱组、槐定碱+inhibitor-NC组和槐定碱+inhibitor组分别加入40 μmol/L的槐定碱，继续培养24 h。

1.5.2 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测细胞中miR-216a-5p 和ZEB1 mRNA 表达 取“1.5.1”项中各组细胞，PBS 清洗，TRIzol 法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 260 nm和280 nm 处 光 密 度（OD）值，OD（260 nm）/OD（280 nm）为1.8 ～2.0 表示RNA 质量较好。反转录cDNA，进行定量PCR 扩增，反应体系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 加至20 μL。按照95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s 的反应程序，共进行40 个循环。根据2-ΔΔCt法计算miR-216a-5p mRNA 和ZEB1 mRNA 表达水平。实验所用引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.3 双荧光素酶报告基因系统验证miR-216a-5p与ZEB1的靶向关系 利用TargetScan 7.2、miRanda等软件预测miR-216a-5p 的下游靶基因，将ZEB1的3’UTR 区域野生型（wild type，wt）和突变型（mutant typ，mut）核苷酸序列分别构建至pGL3-basic载体报告基因Luciferase，构建荧光素酶质粒。取对数期A549 细胞，调整细胞密度为1×106/mL，接种于6 孔板，待细胞铺满约50%时，将wt ZEB1和mut ZEB1质粒载体，分别与miR-216a-5p mimic和miR-216a-5p mimic-NC 共转染，孵育48 h。弃去培养基，裂解细胞，检测萤火虫荧光素酶活性和内参海肾荧光素酶活性，相对荧光素酶活性以二者比值表示。

1.5.4 Western Blot 法检测细胞中ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表达 收集“1.5.1”项中各组细胞，PBS清洗，加入200 μL蛋白提取液，冰上裂解30 min，12000 r/min（离心半径8 cm）离心5 min，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法检测细胞蛋白浓度，制胶、上样；进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；TBST 溶液洗膜，加入5%脱脂奶粉室温下封闭2 h；TBST溶液洗膜，将膜放入稀释后的ZEB1（1∶800）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗中，4 ℃孵育过夜；TBST溶液洗膜，将膜放入稀释后的HRP 标记的二抗（1∶3000）中，室温避光孵育2 h；TBST 溶液洗膜，加入电化学发光（ECL）发光液，室温孵育1 min，进行显色分析。应用ImageJ 软件进行灰度值分析，以ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示其相对表达水平。

1.6 统计方法采用SPSS 24.0统计软件对数据进行处理分析，计量资料以均数± 标准差（x±s）表示。多样本比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度槐定碱对A549细胞增殖能力的影响各浓度槐定碱作用后，A549 细胞增殖抑制率均较空白组升高，且随着槐定碱浓度增加，A549细胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同浓度槐定碱对A549 细胞均有增殖抑制作用。具体结果见图1。槐定碱作用于A549 细胞的IC20为38.56 μmol/L，故后续实验选取接近IC20的浓度：40 μmol/L。

图1 不同浓度槐定碱对A549细胞增殖能力的影响Figure 1 Effect of different concentrations of locustine on the proliferative capacity of A549 cells

2.2 不同浓度顺铂对A549细胞增殖能力的影响各浓度顺铂作用后，A549 细胞增殖抑制率均较空白组升高，且随着顺铂浓度增加，A549 细胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同浓度顺铂对A549细胞均有增殖抑制作用。具体结果见图2。顺铂作用于A549 细胞的IC20为1.93 nmol/L，故后续实验选取接近IC20的浓度：2.0 nmol/L。

图2 不同浓度顺铂对A549细胞增殖能力的影响Figure 2 Effect of different concentrations of cisplatin on the proliferative capacity of A549 cells

2.3 槐定碱对顺铂处理的A549 细胞集落形成的影响对照组、槐定碱组、顺铂组和槐定碱+顺铂组细胞集落数分别为（336.26 ± 23.15）、（172.15 ±18.19）、（162.57 ± 16.23）、（96.58 ± 13.64）个。与对照组比较，槐定碱组、顺铂组和槐定碱+顺铂组细胞集落数均减少（P＜0.05）；槐定碱+顺铂组细胞集落数少于槐定碱组和顺铂组（P＜0.05）。表明槐定碱可增强顺铂对A549 细胞集落形成的抑制作用。结果见图3。

图3 各组平板克隆实验结果Figure 3 Results of plate cloning experiments for each group

2.4 槐定碱对顺铂处理的A549 细胞凋亡的影响对照组、槐定碱组、顺铂组和槐定碱+顺铂组细胞凋亡率分别为：（2.34 ± 0.79）%、（12.15 ±1.26）%、（15.74±1.35）%、（22.68±1.57）%。与对照组比较，槐定碱组、顺铂组和槐定碱+顺铂组细胞凋亡率均升高（P＜0.05）；槐定碱+顺铂组细胞凋亡率高于槐定碱组和顺铂组（P＜0.05）。表明槐定碱可增强顺铂对A549 细胞的促凋亡作用。结果见图4。

图4 各组A549细胞凋亡的流式散点图Figure 4 Flow cytometry scatter plot for A549 cell apoptosis in each group

2.5 槐定碱对A549 细胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA 表达的影响与control组和inhibitor-NC组比较，inhibitor组miR-216a-5p 表达水平降低，ZEB1 mRNA表达水平升高（均P＜0.05）；与control组比较，槐定碱组miR-216a-5p 表达水平升高，ZEB1 mRNA表达水平降低（均P＜0.05）；与inhibitor组比较，槐定碱+inhibitor组miR-216a-5p 表达水平升高，ZEB1 mRNA 表达水平降低（均P＜0.05）；与槐定碱组、槐定碱+inhibitor-NC组比较，槐定碱+inhibitor组miR-216a-5p 表达水平降低，ZEB1 mRNA表达水平升高（均P＜0.05）。表明下调A549细胞中miR-216a-5p 可促进ZEB1 mRNA 表达，而槐定碱可减弱下调miR-216a-5p 对ZEB1 mRNA 表达的促进作用。具体结果见表2。

表2 各组A549细胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

表2 各组A549细胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

①P＜0.05，与对照（control）组比较；②P＜0.05，与抑制剂阳性对照（inhibitor-NC）组比较；③P＜0.05，与抑制剂（inhibitor）组比较；④P＜0.05，与槐定碱组比较；⑤P＜0.05，与槐定碱+inhibitor-NC组比较

组别control组inhibitor-NC组inhibitor组槐定碱组槐定碱+inhibitor-NC组槐定碱+inhibitor组F值P值miR-216a-5p 1.01±0.121.02±0.100.13±0.05①②1.79±0.14①1.82±0.16②④1.18±0.11③④⑤172.459＜0.001 ZEB1 mRNA 1.02±0.111.01±0.122.59±0.18①②0.35±0.06①0.33±0.05②④1.76±0.15③④⑤335.621＜0.001

2.6 双荧光素酶实验转染miR-216a-5p mimic可明显降低ZEB1 wt 相对荧光素酶活性（P＜0.05），而对ZEB1 mut 相对荧光素酶无显著性影响（P＞0.05），表明miR-216a-5p 可靶向调控ZEB1 的表达。具体结果见图5。

图5 miR-216a-5p与ZEB1的靶向关系Figure 5 The targeting relationship between miR-216a-5p and ZEB1

2.7 槐定碱对A549 细胞ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响与control组和inhibitor-NC组比较，inhibitor组ZEB1、Bcl-2 蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低（均P＜0.05）；与control组比较，槐定碱组ZEB1、Bcl-2 蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高（均P＜0.05）；与inhibitor组比较，槐定碱+inhibitor组ZEB1、Bcl-2 蛋白表达水平降低，Bax 蛋白表达水平升高（均P＜0.05）；与槐定碱组、槐定碱+inhibitor-NC组比较，槐定碱+inhibitor组ZEB1、Bcl-2 蛋白表达水平升高，Bax 蛋白表达水平降低（均P＜0.05）。表明下调A549 细胞中miR-216a-5p 可促进ZEB1 蛋白表达，抑制细胞凋亡，而槐定碱可减弱miR-216a-5p 表达下调所致的抑凋亡作用。具体结果见表3、图6。

图6 各组A549细胞中ZEB1、Bcl-2、Bax的Western Blot电泳图Figure 6 Western Blot electrophoretogram of ZEB1，Bcl-2 and Bax in various groups of cells

表3 各组细胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

表3 各组细胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

①P＜0.05，与对照（control）组比较；②P＜0.05，与抑制剂阳性对照（inhibitor-NC）组比较；③P＜0.05，与抑制剂（inhibitor）组比较；④P＜0.05，与槐定碱组比较；⑤P＜0.05，与槐定碱+inhibitor-NC组比较

组别control组inhibitor-NC组inhibitor组槐定碱组槐定碱+inhibitor-NC组槐定碱+inhibitor组F值P值ZEB1蛋白相对表达量0.78±0.080.76±0.071.16±0.12①②0.15±0.04①0.17±0.04②④0.89±0.07③④⑤179.523＜0.001 Bcl-2蛋白相对表达量0.82±0.080.80±0.071.19±0.10①②0.21±0.06①0.23±0.05②④0.97±0.09③④⑤183.259＜0.001 Bax蛋白相对表达量0.43±0.060.45±0.050.16±0.04①②1.07±0.09①1.05±0.05②④0.31±0.05③④⑤211.467＜0.001

3 讨论

非小细胞肺癌（NSCLC）发病机制复杂，与基因突变、细胞信号通路传导改变及新生血管异常等多种因素有关，手术切除不能完全治愈，且术后肿瘤易发生转移、复发，患者5年生存率仍较低[12]。通过化疗辅助治疗NSCLC，可在一定程度上减少肿瘤复发和转移。以顺铂为基础的化疗是延长患者生存期的主要手段之一，顺铂可抑制肿瘤细胞DNA 复制和RNA 合成，阻止细胞有丝分裂，抑制细胞增殖和诱导凋亡；然而化学耐药性已成为制约铂类药物充分发挥治疗效果的主要原因[13]。近年来，国内外学者开始从天然产物及其衍生物中寻找有效的抗肿瘤方法。大量实验结果表明，部分中药单体联合放化疗可产生增效或减毒效应[14-15]。本研究选择中药苦豆子主要生物碱成分槐定碱作用于顺铂处理的人肺腺癌A549 细胞株，探讨其能否提高细胞的化疗敏感性。结果表明，槐定碱可增强顺铂对A549 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，提示其可提高肺腺癌细胞对化疗的敏感性。

另外，有研究证实，miRNA 有调节肿瘤细胞耐药性和敏感性的作用[16]。miR-216a-5p与多种肿瘤关系密切，在不同肿瘤中的作用不尽相同。体外细胞实验证实，miR-216a-5p mimic 可促进肾细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭[17]，而miR-216a-5p抑制剂则发挥相反作用[18]。Zhang 等[19]研究发现，miR-216a-5p 在胰腺癌组织和细胞系中明显下调，低表达的miR-216a-5p 可促进胰腺癌细胞生长和肿瘤进展。国内外研究均报道，下调miR-216a-5p表达可促进肺癌细胞增殖和侵袭[20-21]。为进一步阐明槐定碱抗肺腺癌的作用机制，本研究转染miR-216a-5p inhibitor 至A549 细 胞 后，A549 细 胞 中miR-216a-5p 表达较control组和inhibitor-NC组明显下降，而槐定碱组miR-216a-5p 表达较control组和inhibitor-NC组明显升高，表明槐定碱可上调miR-216a-5p 表达。转染miR-216a-5p inhibitor 后继续使用槐定碱处理A549 细胞，细胞中miR-216a-5p上调趋势被抑制，表明槐定碱参与调控肺腺癌细胞miR-216a-5p的表达。miR-216a-5p可通过调控下游靶基因发挥相关生物学作用。本研究经双荧光素酶实验证实ZEB1 是miR-216a-5p 的下游靶基因，进一步观察槐定碱对A549 细胞ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响，结果表明，槐定碱上调miR-216a-5p表达时，使ZEB1、Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达升高，提示槐定碱可能通过上调miR-216a-5p 表达，靶向降低ZEB1 表达，调控A549 细胞凋亡相关蛋白表达，起到抑制肺腺癌的作用。

综上所述，本研究初步证实槐定碱对A549 细胞具有一定的增殖抑制及促凋亡作用，并可提高A549 细胞对顺铂的敏感性，还可通过上调miR-216a-5p 靶向下调ZEB1 表达，调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 等表达，进而发挥抗肺腺癌的作用。但本研究仅采用体外实验检测槐定碱的药理学功效，今后有待进行体内实验验证其靶向抗肿瘤作用及安全性。