maspin、Cyclin-1与胃癌临床分期及VEGF的相关性分析

王 力，邸 静

商洛国际医学中心医院病理科，陕西商洛 726000

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，其发生、发展和转移存在多因素、多阶段过程，且具有发展快、预后较差等特点，是现阶段严重危害人们生命健康的重要因素之一。胃癌患者根治术后5年存活率仅维持在20%～30%，因此，胃癌的早期诊断及治疗对于改善预后有重要意义[1]。maspin 是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，相关研究表明，maspin可作为一种抑癌基因，对降低癌细胞活性、诱导癌细胞凋亡、减少肿瘤组织内血管新生等均具有调节作用[2]。细胞周期调控异常易引发肿瘤形成，而Cyclin-1是调控细胞周期的重要细胞因子，Cyclin-1基因发生移位或扩增会导致其在胃癌组织中过度表达，从而加重病情[3]。血管内皮生长因子(VEGF)是诱导肿瘤血管生长的关键因子之一，VEGF是已知最强有力的血管生成因子，在肿瘤的持续生长和转移中起重要作用。相关研究表明，VEGF的表达与胃癌的分期、淋巴结转移及预后密切相关，参与胃癌的发生和发展[4]。在对maspin、Cyclin-1、VEGF作用的研究中发现，3项指标均可作为判断肿瘤侵袭和转移的潜能因子，并且在胃癌远处转移和预后预测中均具有一定作用，也在胃癌治疗中明确病理的发生和发展具有一定影响，但具体机制还需进一步研究[5-6]。本研究对maspin、Cyclin-1与胃癌临床分期及VEGF的相关性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年5月本院收治的进行根治手术的240例胃癌患者作为研究对象，男126例，女114例；≤50岁126例，>50岁114例；贲门部75例，胃体部86例，胃窦部79例；Borrmann分期：Ⅰ、Ⅱ期135例，Ⅲ、Ⅳ期105例；管状腺癌63例，黏液腺癌57例，印戒细胞癌39例，鳞状细胞癌81例；肿瘤最大径≤4.0 cm 136例，>4.0 cm 104例；组织学类型：高分化型85例，中分化型87例，低分化型68例；有浆膜浸润109例，无浆膜浸润131例；有淋巴结转移96例，无淋巴结转移144例。不同病理类型、不同Borrmann分期、有无浆膜浸润及有无淋巴结转移等一般资料比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其余资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：所有患者均经病理检查确诊为胃癌；术前未经放疗、化疗或其他肿瘤相关治疗，所有患者临床资料均完整。排除标准：有其他肿瘤病史，代谢异常性疾病，患急性心、脑血管疾病，肺、肝、胆、肾等重要器官发生可见占位性病变。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂 鼠抗人maspin浓缩型单克隆抗体，兔抗人Cyclin-1、VEGF浓缩型多克隆抗体和免疫组织化学检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 方法

1.3.1 标本留取 所有胃癌标本均行常规10%甲醛固定，均在24 h内取材。标本采集：于距病灶3 cm以外的癌旁组织取1块，癌中心部位取1块，使用切片机将组织切片，每张切片厚度为3～5 cm。染色前将石蜡切片置于二甲苯中脱去石蜡，采用10%甲醛固定做石蜡切片，依次采用无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和 70%乙醇脱水后，用清水冲洗，在90 ℃烤箱中烘烤20 min后于苏木素中染色10 min，清洗后，65 ℃烤箱烘干后用中性树脂封片，组织切片于显微镜下观察后拍照。

1.3.2 免疫组织化学染色法 将二甲苯脱蜡2次，每次10 min，梯度95%乙醇水化2次,每次3 min,80%乙醇水化3 min，70%乙醇水化3 min，蒸馏水水化2次，每次5 min,后置于盛有pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液修复盒中，压力锅中高压修复3 min。3% 过氧化氢37 ℃ 孵育10～20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min，滴加一抗maspin、Cyclin-1及VEGF工作浓度分别为1∶200、1∶400 和1∶700，37 ℃ 孵 育60 min。滴加聚合物辅助剂，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG多聚体，37 ℃ 孵育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加新鲜配制的四盐酸氨基苯胺显色液，显微镜下观察3～5 min，至出现阳性结果而又无明显背景着色时终止反应，自来水冲洗，苏木精复染5 min，2% 盐酸乙醇分化10 s，自来水返蓝15 min，切片自然风干，中性树胶封片。maspin、Cyclin-1蛋白表达以细胞质、细胞核中出现褐色或棕黄颗粒为阳性染色，VEGF表达以细胞质中出现褐色或棕黄色颗粒为阳性染色，按每张切片随机取5个高倍镜视野，计数100个细胞，阳性细胞数≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分;阳性强度黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分。0～6分表示阳性(+)，8～12分表示强阳性(++)，所得积分相乘，将(+)、(++)归为表达阳性组计算阳性率。

1.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 所有患者均于治疗前清晨抽取空腹静脉血5 mL，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，吸取血清至 Eppendof 管中，做好标记，-80 ℃冷冻保存备用，采用 ELISA 按照试剂盒说明书进行严格操作，以450 nm 处测定吸光度值共3次，取平均值，参照厂家提供的血清VEGF水平及吸光度标准曲线读取标本中血清VEGF水平。

2 结 果

2.1 胃癌组织与癌旁组织maspin、Cyclin-1阳性表达情况比较 胃癌组织中maspin阳性42例，Cyclin-1阳性174例；癌旁组织中maspin阳性198例，Cyclin-1阳性66例，与胃癌组织比较，癌旁组织中maspin阳性表达情况较高，Cyclin-1阳性表达情况较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1、图2。

图1 胃癌组织和癌旁组织maspin阳性表达情况比较(×200)

图2 胃癌组织和癌旁组织Cyclin-1阳性表达情况比较(×200)

表1 胃癌组织及癌旁组织maspin、Cyclin-1阳性表达情况比较[ n(%)]

2.2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者maspin、Cyclin-1阳性表达情况比较 Ⅰ期胃癌患者maspin阳性21例，Cyclin-1阳性36例；Ⅱ期胃癌患者maspin阳性12例，Cyclin-1阳性48例；Ⅲ期胃癌患者maspin阳性9例，Cyclin-1阳性42例；Ⅳ期胃癌患者maspin阳性0例，Cyclin-1阳性48例。各期胃癌患者maspin和Cyclin-1阳性表达情况比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与Ⅰ期胃癌患者比较，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1阳性表达情况差异均有统计学意义(P<0.05)；Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1阳性表达情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、图4、表2。

图3 各期胃癌患者maspin阳性表达情况(×200)

图4 各期胃癌患者Cyclin-1阳性表达情况(×200)

表2 各期胃癌患者maspin、Cyclin-1阳性表达情况比较[ n(%)]

2.3 各期胃癌患者VEGF表达水平比较 Ⅰ期胃癌患者VEGF表达水平为(62.60±7.22)pg/mL，Ⅱ期胃癌患者为(85.20±15.25)pg/mL，Ⅲ期胃癌患者为(118.30±22.34)pg/mL，Ⅳ期患者为(140.30±30.56)pg/mL，各期胃癌患者VEGF表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

2.4 胃癌患者maspin、Cyclin-1与VEGF的相关性分析 maspin与VEGF呈负相关(r=-0.365，P<0.05)，maspin与Cyclin-1呈负相关(r=-0.298，P<0.05)，Cyclin-1与VEGF呈正相关(r=0.386，P<0.05)。见图6。

注：与Ⅰ期比较，*P<0.05；与Ⅱ期比较，#P<0.05；与Ⅲ期比较，△P<0.05。

图6 胃癌患者maspin、Cyclin-1与VEGF的相关性分析

3 讨 论

胃癌是由多基因调节和多因素导致的细胞大量增殖及细胞凋亡受抑制的结果，Cyclin-1作为周期蛋白的调控基因，当基因表达异常时会引起细胞周期调节失控，促进肿瘤的发生和发展[7]。maspin在生物学功能中通过抑制肿瘤细胞活性进而提高细胞的黏附能力和细胞外基质的稳定性,降低癌变细胞运动能力，抑制肿瘤增长，诱导癌细胞凋亡[8]。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤相关血管的形成，并为其提供营养物质，以及为肿瘤细胞进入循环系统提供通道。目前，常用的评价血管生成的指标主要为VEGF，作为肿瘤细胞分泌的最重要的肿瘤血管形成促成因子，其在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用[9]。因此，加强对maspin、Cyclin-1、VEGF在胃癌中的作用机制研究，可为胃癌今后的诊断、治疗及预后提供依据。

近年来相关研究发现，maspin、Cyclin-1在胃癌患者中的表达水平与肿瘤的生长和癌细胞转移及浸润等均具有相关性，maspin、Cyclin-1在正常胃黏膜组织和胃癌组织中均有不同表现，且在胃癌组织中的表达与癌旁组织中的表达水平存在明显差异[10]。本研究结果显示，胃癌组织中maspin阳性表达较低，Cyclin-1阳性表达较高，癌旁组织中maspin阳性表达较高，Cyclin-1阳性表达较低，二者呈负相关，提示maspin表达缺失、Cyclin-1表达升高在胃癌中可能发生致癌基因的作用。WANG 等[11]研究表明，胃癌组织中maspin的表达缺失高达71.00%，maspin的低表达和表达缺失与胃癌的分化、分期及肿瘤的生物学特性和临床预后、治疗转归等均密切相关，且maspin在胃癌组织中表达下调可能导致癌细胞黏附增加和细胞运动能力加强，引起胃癌发生和发展。相关研究显示，Cyclin-1可与周期抑制蛋白相结合增强癌细胞活性，Cyclin-1过表达可加速细胞周期进展甚至使细胞向恶性转化，Cyclin-1也是控制真核细胞周期进展的重要蛋白分子，可结合细胞周期蛋白依赖性激酶4而形成复合物Cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，将细胞周期从低分期进入高分期，进而加重胃癌病变[12-13]。

maspin、Cyclin-1在胃癌分期中的表达水平与胃癌的恶性程度具有重要相关性，因此，maspin、Cyclin-1在参与胃癌发生和发展过程中可能是重要的生物学标志物。本研究中胃癌患者maspin阳性呈低表达，与之相反，Cyclin-1在胃癌患者中阳性呈高表达，由此提示，maspin、Cyclin-1水平与胃癌分期具有相关性。BOSTANCI等[14]通过免疫组织化学法研究表明，高分期胃癌中maspin的阳性表达明显低于胃癌低分期，且发现maspin在低分期中主要表达于细胞质，而在高分期中主要表达于细胞核中。随着胃癌分期增加，maspin在胃癌中胃黏膜的表达量随之降低，表明maspin在胃癌中呈低表达且肿瘤的恶性程度较高，检测其水平对预后评估具有重要意义[15]。HUANG等[16]研究显示，Cyclin-l在胃癌低分期中能够形成复合物，并通过激活蛋白激酶的活性使母细胞瘤蛋白磷酸化，进行转录因子释放，进而驱使癌细胞由低分期进入高分期，促进癌细胞增殖和肿瘤发生。Cyclin-1过表达能够提前实现母细胞瘤蛋白的磷酸化过程，同时加快细胞从低分期向高分期的转变速度，增加癌细胞增殖。

有关研究证实，所有恶性肿瘤的生物学行为均与肿瘤内新生血管有关，而肿瘤血管的生成在实体肿瘤的发生、发展、浸润及转移等各阶段均具有促进作用[17]。VEGF是已知最强有力的血管生成因子，并且可作为胃癌诊断、治疗及预后动态观察的指标。本研究中Ⅰ期胃癌患者VEGF表达水平最低，并且随着分期越高VEGF表达水平不断升高，表示VEGF与胃癌分期具有相关性，也是胃癌等恶性生物学行为的重要标志。相关研究表明，在处于进展阶段的胃癌中，肿瘤组织增生活跃会分泌大量的VEGF进入血液，可能是由于环氧化酶的过度表达促进了前列腺素的合成，进而刺激VEGF分泌，伴随肿瘤血管形成和胃癌分期升高，进而促进胃癌的侵袭和转移能力，这也是晚期胃癌患者血清VEGF水平较高的重要原因[17]。唐欢等[18]研究表明，胃癌组织内的大量新生肿瘤血管的形成受多种血管生成因子的调节，在排除创伤和炎性反应前提下，血清VEGF水平呈高表达，提示肿瘤分期的提高可能伴随活跃癌症中新生血管因子及潜在癌细胞转移的趋势。因此，VEGF在胃癌的发生和发展中具有重要作用。ZANG等[19]研究结果显示，maspin与VEGF、Cyclin-1的表达水平均呈负相关，原因可能是因为maspin阳性表达下调或缺失为肿瘤的浸润转移创造了适合的微环境，间接促进了Cyclin-1、VEGF-C等的表达、分泌及趋化作用。而maspin阳性表达下调后对凋亡相关基因的诱导作用下降，又为癌细胞浸润后淋巴细胞的增殖创造了条件，进一步上调VEGF、Cyclin-1的表达水平。

综上所述，maspin在胃癌组织中呈低表达，Cyclin-1在胃癌组织中呈高表达，且不同分期胃癌患者maspin、Cyclin-1阳性表达情况及VEGF水平不同，提示通过检测maspin、Cyclin-1阳性表达情况及VEGF水平对胃癌的诊断和分期有重要作用。