发酵中草药对活性成分释放及仔猪生长和粪微生物的影响

张 涛, 倪晋东, 葛金山, 朱元召,4*, 闻爱友， 彭宇晗, 张海洋, 姜国圆， 孙露露

(1.安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100；2.江苏优仕生物科技发展有限公司，江苏 宿迁 223831； 3.山东众成饲料科技有限公司，山东 肥城 271600；4.河北和利美生物科技有限公司，河北 青县 062650)

发酵中草药作为一种新型饲料添加剂,尤其作为抗生素替代品正成为研究热点之一。中草药含有黄酮、生物碱、皂苷、多糖和酚类等活性成分,经发酵后其中的大分子转化为易于吸收的小分子物质,在发酵过程中还能释放更多活性成分,产生新的活性物质,减轻毒性,增强中草药药效[1-2]。研究表明,采用不同比例的乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、里氏木霉,对党参、黄芪、益母草、甘草4种药渣进行混菌发酵,还原糖含量最高分别提高 36%、40%、30.8%、66%[3]。宗凯等[4]测得蒲公英经黑曲霉发酵后总黄酮质量浓度为0.097 mg/mL,较发酵前提高了5倍。杜晨晖等[5]利用酿酒酵母ATCC9763对葛根芩连汤进行发酵,总生物碱含量提高24.91%。此外,发酵中草药能提高饲料适口性以及中草药利用率[6],提高畜禽生产性能[7],改善产品质量[8]。中草药具有保健和治疗疾病作用,经有益微生物发酵后,可发挥中草药与微生物的双重叠加功效,提高动物免疫力[9],调节胃肠道菌群平衡和健康[10],替代饲用抗生素。

断奶应激引起断奶仔猪厌食、生产性能下降和免疫力降低[11]。武洪志等[12]研究表明,在断奶仔猪日粮中添加0.2%发酵复方中草药后,平均日采食量和平均日增重显著提高,料重比和腹泻率显著降低。曲浩杰[13]研究发现,饲粮中添加600 mg/kg由黄柏、黄芩、黄连和大黄经厌氧发酵后的中药复方发酵粉,能显著降低粪大肠杆菌数量。目前有关发酵中草药及其在畜禽中的应用研究较少,所采用的复合中草药组方不同、发酵中草药添加量存在差异,并多采用厌氧方式发酵中草药,对中药坚实的细胞壁降解程度较低。因此,本研究采用先好氧后厌氧的菌酶协同异步发酵方法,研究发酵中草药细胞壁降解程度和细胞内活性成分含量变化及对断奶仔猪生长、腹泻和粪微生物的影响,为发酵中草药在畜禽中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

复方中草药由十大功劳叶、苦木、石榴皮、马齿苋和鬼针草组成,配伍比例为30%、20%、20%、15%和15%。将各种中草药原料先粉碎过40目筛再混合均匀。中草药原料(亳州市乾元动物药业有限公司)。纤维素酶(酶活性为10 000 U/g);复合酶(由木聚糖酶3 000 U/g、蛋白酶5 000 U/g、甘露聚糖酶200 U/g、纤维素酶2 000 U/g、α-淀粉酶250 U/g、葡聚糖酶10 000 U/g组成)。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum):分别含活菌2×1010CFU/g、1×1010CFU/g。培养基(MRS琼脂、双歧杆菌BS培养基、LB营养琼脂,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

1.2 试验设计

选用(28±2)日龄遗传背景相似、健康状况良好的杜长大三元杂交断奶仔猪90头,随机分为3组,对照组饲喂基础日粮,粉碎复方中草药组、发酵复方中草药组分别饲喂含2%粉碎复方中草药、2%发酵复方中草药的试验组日粮,试验期为28 d。断奶仔猪日粮组成及营养水平见表1(风干基础)。

表1 断奶仔猪日粮组成及营养水平

续表1

粉碎复方中草药和发酵复方中草药配方见表2。

表2 粉碎复方中草药和发酵复方中草药配方及含量

1.3 粉碎复方中草药与发酵复方中草药制备

发酵复方中草药采用菌酶联合异步发酵法,按表2原料组成,第一步进行好氧发酵,先将50%红糖、枯草芽孢杆菌放入50%的40～45 ℃水中,活化30～45 min;再将玉米、豆粕与复方中草药、纤维素酶和复合酶按比例混合均匀,并将活化枯草芽孢杆菌菌液均匀接种至上述混合物中,37 ℃条件下好氧发酵20 h。第二步进行厌氧发酵,先将余下的50%红糖、植物乳杆菌放入50%的40～45 ℃水中,活化30～45 min,均匀接种至耗氧发酵后的混合物中,密闭,37 ℃条件下厌氧发酵5 d,制备得到发酵复方中草药。

1.4 测定指标及分析方法

1.4.1 纤维含量测定 粗纤维(CF)在粗纤维测定仪(美国ANKOM A220)中,对盛有样品的纤维滤袋进行酸碱消煮,按GB/T 6434-2006方法测定。中性洗涤纤维(NDF)采用中性洗涤剂(3%十二烷基硫酸钠溶液)洗涤测定,按GB/T 20806-2006测定方法操作。酸性洗涤纤维(ADF)采用酸性洗涤剂(2%十六烷基三甲基溴化铵溶液)洗涤测定,按GB/T 20805-2006测定方法操作。

1.4.2 复方中草药活性成分测定 精密称取样品3.0 g,置于索氏提取器中,按照料液比1∶30加入80%乙醇,回流提取时间2 h,提取2次,合并浓缩提取液。取提取液一定量于100 mL容量瓶中,加60%乙醇溶解至刻度,精密吸取1 mL样品液置于比色管中,用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮[14]。精密称取样品4.0 g至250 mL锥形瓶中,加20倍量70%乙醇于720 W超声提取2次,每次20 min,合并提取液,50 ℃减压浓缩至干,加甲醇溶解并定容至10 mL。精密吸取供试品溶液各0.5 mL,分别置于10 mL具塞比色管中,70 ℃水浴蒸干,用香草醛-高氯酸比色法测定总皂苷[15]。精密称取样品3.0 g,加入95%乙醇36 g置入带塞小瓶中,超声波萃取60 min,蒸干,加入0.1 mol/L盐酸定容至50 mL。吸取溶液30 mL, 置于比色管中,用雷氏盐比色法测定总生物碱[16]。精密称取0.3 g样品,放入锥形瓶中,利用超声提取,冷却过滤,旋转蒸发浓缩。称取样品5 mg配制成0.1 mg/mL多糖溶液,用苯酚-硫酸法测定粗多糖[17-18]。

1.4.3 断奶仔猪生长性能测定 以重复组为单位,每日记录断奶仔猪采食量。在试验开始第1、14、28天06:00分别对仔猪进行空腹称重,计算断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.4 腹泻指数测定 以重复组为单位,每天观察和记录断奶仔猪粪便、腹泻和健康情况。腹泻指数评分标准见表3[19]。由5人评分组分别打分,取评分平均值,计算断奶仔猪腹泻指数。

腹泻指数=粪便评分之和/试验仔猪头数。

表3 断奶仔猪腹泻指数评分标准

1.4.5 粪便微生物测定 试验第26～28天,于06:00采集各重复组健康猪新鲜粪样,混匀密封,0 ℃以下保存。对粪样10倍配比稀释,分别置于37 ℃的LBS培养基、BS培养基、LB培养基中培养48 h,采用平板菌落计数法,分别计数测定乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌。培养基配制方法均严格按照说明书进行。

1.5 数据处理

数据用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用邓肯氏法(Duncan)多重比较进行检验,结果以“平均值±标准差”表示,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复方中草药异步发酵后纤维和活性成分含量变化

与未发酵粉碎复方中草药相比(表4),发酵复方中草药粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别降低19.66%、22.18%和14.57%,差异均显著(P<0.05);总黄酮、总生物碱、总皂苷和粗多糖分别提高3.77%、4.55%、55.84%和164.97%,差异均显著(P<0.05)。

表4 中草药发酵前后纤维和活性成分含量变化

2.2 发酵复方中草药对断奶仔猪生长性能的影响

与无中草药对照组相比(表5),粉碎复方中草药组断奶仔猪平均日增重(ADG)和平均日采食(ADFI)分别提高21.48%和0.90%,差异均不显著(P>0.05);发酵复方中草药组ADG和ADFI分别显著提高40.27%和16.82%(P<0.05);粉碎复方中草药组和发酵复方中草药组断奶仔猪料重比(F/G)均显著降低17.20%和16.67%(P<0.05)。与粉碎复方中草药组相比,发酵复方中草药组断奶仔猪ADG和F/G分别提高15.47%、降低0.65%,均无显著差异(P>0.05),ADFI显著提高15.77%(P<0.05)。

表5 异步发酵复方中草药对断奶仔猪生长性能的影响

2.3 发酵复方中草药对断奶仔猪腹泻指数的影响

与对照组相比(表6),在试验1～2、3～4周和试验全期粉碎复方中草药组断奶仔猪腹泻指数分别降低13.26%、33.33%和21.63%,均无显著差异(P>0.05);发酵复方中草药组腹泻指数分别下降33.48%、74.96%和46.71%,差异均显著(P<0.05)。与粉碎复方中草药组相比,发酵复方中草药组断奶仔猪腹泻指数在试验1～2周、试验全期分别下降22.93%、32.00%,均无显著差异(P>0.05),在试验3～4周腹泻指数显著下降62.44%(P<0.05)。

表6 异步发酵复方中草药对断奶仔猪腹泻指数的影响

2.4 发酵复方中草药对断奶仔猪粪微生物的影响

与对照组相比(表7),粉碎复方中草药组断奶仔猪粪乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量均无显著改变(P>0.05),发酵复方中草药组乳酸菌和双歧杆菌数量分别提高32.63%、38.16%,差异均显著(P<0.05),大肠杆菌数量显著降低39.30%(P<0.05)。与粉碎复方中草药组相比,发酵复方中草药组断奶仔猪粪乳酸菌和大肠杆菌数量分别显著提高28.57%、降低30.34%(P<0.05);双歧杆菌数量提高23.66%,但无显著差异(P>0.05)。

表7 异步发酵复方中草药对断奶仔猪粪微生物的影响

3 结论与讨论

3.1 中草药异步发酵后细胞壁的降解和细胞内活性成分的释放

中草药中的有效成分大多被坚硬的细胞壁包裹在细胞内。中草药细胞壁主要是木质素、纤维素、果胶等结构成分,不易被破坏和分解,胞内所含活性成分不易被释放,影响中草药功效发挥。研究表明,微生物发酵所产生的酶如纤维素酶和果胶酶,可降解植物细胞壁,有助于中草药中的活性成分溶出[20]。通过微生物固态厌氧发酵烟梗4 d后,芽孢杆菌可较好地分解木质素和半纤维素,木质素和半纤维素的含量分别由10.91%和10.66%降至5.55%和7.40%;乳酸菌将纤维素由20.83%降解至15.90%[21]。金顺义等[22]用含有产朊假丝酵母、干酪乳杆菌、粪肠球菌的复合益生菌发酵王不留行和益母草,发酵后中草药中的黄酮、生物碱、粗多糖、皂苷等成分较未发酵前分别增加55.14%、27.28%、55.42%、49.21%。本试验结果显示,发酵复方中草药较未发酵粉碎中草药组粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别均显著降低19.66%、22.18%和14.57%;总黄酮、总生物碱、总皂苷和粗多糖分别均显著提高3.77%、4.55%、55.84%、164.97%,与上述发酵处理能降低中草药细胞壁纤维和增加中药活性成分含量的研究结果较为相似,但纤维和活性成分发酵前后含量变化存在差异。本试验采用先枯草芽孢杆菌好氧发酵、再植物乳杆菌厌氧发酵的异步发酵以及添加纤维素酶等外源酶的协同方法,显示能够较好降解复方中草药细胞壁,这是由于好氧加酶发酵对细胞壁的裂解较厌氧发酵具有更强效果,进一步提示菌酶协同异步发酵较普通粉碎过40目筛加工处理中草药,能更好地解除细胞壁对中药有效成分释放的束缚,本试验复方中草药发酵后总黄酮、总生物碱、总皂苷和粗多糖等活性物质含量的显著增加也相互佐证了结果。本试验中草药发酵后的总黄酮、总生物碱含量增加较少而粗多糖含量增加较多,这可能与复方中草药组成及其所含总黄酮、总生物碱及粗多糖含量以及发酵方式等因素有关,尚需深入探讨。

3.2 粉碎中草药与发酵中草药对断奶仔猪生长性能的影响

有关发酵中草药对断奶仔猪生长性能影响的研究较少。张玉千[23]采用嗜酸乳杆菌、安琪啤酒酵母和植物乳杆菌等混菌,发酵五倍子、女贞子、山楂、甘草、厚朴五味复方中药渣,按10 kg/t添加至断奶仔猪日粮中,发现能显著提高断奶仔猪平均日增重9.96%。邹志恒等[24]在党参、黄芪、茯苓、白术、山楂复方中药中接种乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌,发酵后,在日粮中添加0.4%即能提高断奶仔猪平均日增重25.05%、降低料重比25%。本试验结果显示,与对照组相比,粉碎复方中草药显著降低断奶仔猪料重比17.20%，而对日增重无显著影响。而发酵复方中草药对断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和料重比均有显著改善,与上述发酵中草药提高仔猪日增重的研究结果较为相似。这是由于本试验十大功劳叶、苦木等中草药经发酵后,固有的药物苦味降低,乳酸含量提高,使采食量增加,Koo等[25]用乳酸菌发酵小麦饲喂断奶仔猪,发现也能够改善适口性和营养物质消化利用率。此外,中草药发酵后,其多糖、黄酮等活性成分显著增加,并通过有益菌作用产生淀粉酶等内源性酶和大量有机酸,从而调节断奶仔猪胃肠道健康和促进消化吸收,提示发酵复方中草药较粉碎复方中草药提高断奶仔猪生长性能更显著。

3.3 粉碎中草药与发酵中草药对断奶仔猪腹泻和粪微生物的影响

本试验中,发酵复方中草药较未添加中草药对照组断奶仔猪粪乳酸菌和双歧杆菌分别显著提高32.63%、38.16%、大肠杆菌显著降低39.30%、试验各期腹泻指数均显著降低。马铮财等[26]用乳酸菌发酵五味子、车前子、人参茎叶复合中草药,再添加到断奶仔猪日粮中,其结果与本试验相似,即仔猪肠道内乳酸菌数量增多,大肠杆菌数量减少;张玉千[23]将发酵五倍子、女贞子、山楂等中草药添加在断奶仔猪日粮中,证实能增加仔猪肠道内双歧杆菌、乳酸菌数量,减少大肠杆菌数量;表明发酵中草药能提高断奶仔猪粪有益菌群数量,同时降低粪病原菌数量,减少仔猪腹泻。本试验所用石榴皮富含鞣质和鞣花酸,具有修复肠损伤和抗腹泻功效[27];苦木富含苦木苦味素类、生物碱类化合物等多种药理活性成分,能抗菌消炎、消肿解毒、清热防泻痢;十大功劳叶含小檗碱、巴马汀和药根碱等生物碱,具有抗炎、镇痛、止泻等功效[28];马齿苋和鬼针草也具有清热利湿、杀菌、止痢作用,由这5种中草药配伍成的复方中草药为抑菌止泻型。本试验粉碎复方中草药对断奶仔猪粪微生物数量和腹泻指数有一定改善作用,却无显著差异,这可能与中草药物理粉碎粒度较大(过40目筛)、中草药细胞壁裂解不彻底、胞内活性成分释放较低有关。复方中草药经异步加酶发酵可产生大量乳酸菌、乳酸和免疫活性增强因子等代谢产物,能够有效抑制肠道内大肠杆菌等有害菌群生长,促进乳酸菌、双歧杆菌等有益菌增殖;发酵过程中菌酶协同,中草药黄酮、生物碱、皂苷和多糖等活性成分含量显著增加,刺激机体产生免疫反应,抑菌消炎、清热止泻。提示复方中草药和异步发酵具有双重叠加功效,能够有效调节断奶仔猪肠道微生物菌群平衡,改善机体健康,降低腹泻发生率。

因此,复方中草药经菌酶协同异步发酵后,具有细胞壁更彻底降解和胞内活性成分更多释放的作用。在仔猪日粮中添加异步发酵复方中草药,能够改善断奶仔猪生长性能、降低腹泻和增加粪便中有益菌群数量。