4′-氯-7-[2-(哌嗪-l-基)乙氧基]异黄酮的合成及分析方法的建立

连孟强　刘娅琛　郭春燕

摘要：為解决天然大豆苷元（daidzein，DAI）抗肿瘤活性不足的问题，对DAI的4′位和7位进行结构修饰。首先，以间苯二酚和对氯苯乙酸为起始原料，经傅克酰基化、增碳关环反应制备4′-氯-7-羟基-异黄酮，将4′-氯-7-羟基异黄酮依次与二溴乙烷、哌嗪通过取代反应制备目标化合物4′-氯-7-[2-（哌嗪-l-基）乙氧基]异黄酮（3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one，CPEO-43），采用柱层析方法实现目标产物与杂质的分离。其次，通过FT-IR，MS，1H-NMR及13C-NMR确证结构。再次，通过MTT实验评价化合物CPEO-43对A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞的抑制作用。最后，建立CPEO-43血浆样品的超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）分析方法。结果表明，通过FT-IR，MS，1H-NMR及 C-NMR确证了所合成的化合物与目标化合物结构一致。10 μmol/L DAI对A549肺癌和HCT116结肠癌细胞的抑制率分别为4.421%和5.601%;而相同浓度的CPEO-43对A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞抑制率分别为58.43%和72.03%，IC值分别为2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。建立的UPLC方法无内源性物质干扰，在0.5～10 μg/mL范围内线性关系良好，日内精密度及日间精密度均小于10%，化合物CPEO-43的低、中、高浓度的血浆样品的回收率为92.98%～100.10%。化合物CPEO-43的抗肿瘤活性显著高于DAI，UPLC分析方法能简便快速地测定血浆中CPEO-43的含量，结果准确可靠，可为提高DAI的抗肿瘤效果提供理论依据，为药物临床检测提供方法基础。

关键词：药学其他学科;大豆苷元;大豆异黄酮衍生物;抗肿瘤活性;超高效液相色谱;核磁共振;质谱

中图分类号：R917文献标识码：A

DOI：10.7535/hbkd.2022yx03010

Synthetic and analytical method establishment of 3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one

LIAN Mengqiang LIU Yachen GUO Chunyan

（1.School of Pharmacy，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China;2.School of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang，Hebei 050024，China）

Abstract：In order to solve the problem of insufficient antitumor activity of natural daidzein （DAI），the 4 'and 7 positions of DAI were modified.Firstly，3-（4-chlorophenyl）-7-hydroxy-4H-chromen-4-one was prepared from resorcinol and p-chlorophenylacetic acid by friedel crafts acylation，carbonization and ring closing reaction.The 3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chrome-4-one （CPEO-43） was synthesized by substitution reaction of 3-（4-Chlorophenyl）-7-hydroxy-4H-chromen-4-one with dibromoethane and piperazine.Column chromatography was used to separate the target product from impurities.Secondly，FT-IR，H-NMR，C-NMR and MS were used to identify the compounds.Thirdly，MTT assay was used to detect the inhibitory effect of compound CPEO-43 on A549 lung cancer cells and HCT116 colon cancer cells.Finally，an ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method was established for the analysis of CPEO-43 plasma samples.The results show that the structure of the synthesized compound is consistent with that of the target compound confirmed by FT-IR，MS，1H-NMR and 13C-NMR.The inhibitory rates of DAI （10 μmol/L） on A549 lung cancer and HCT116 colon cancer cells are 4.421% and 5.601%，respectively.The inhibitory rates of the same concentration of CPEO-43 on A549 lung cancer cells and HCT116 colon cancer cells are 58.43% and 72.03%，respectively.The IC values of CPEO-43 are 2.51 μmol/L and 0.87 μmol/L，respectively.The established UPLC method has no interference from endogenous substances.The linear relationship is good in the range of 0.5～10 μg/mL.The intra-day precision and inter-day precision are less than 10%.The average recoveries of low，medium and high plasma samples of compound CPEO-43 are in the range of 92.98%～100.1%.The antitumor activity of compound CPEO-43 is significantly higher than that of DAI.The established UPLC assay method can easily and rapidly determine the content of CPEO-43 in plasma，and the results are accurate and reliable，provide a theoretical basis for improving the antitumor activity of DAI，and provide method basis for drug clinical testing.

Keywords：

other disciplines of pharmacy;daidzein;soybean isoflavone derivatives;antitumor activity;ultra high performance liquid chromatography;nuclear magnetic resonance;mass spectrum

癌症是全球第2大死亡原因，2018年约有960万人死于癌症，占死亡人数的1/6。肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌和肝癌是男性最常见的癌症类型，而乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌和甲状腺癌在女性中最为常见。肺癌和结肠直肠癌在男性和女性中都是最常见的癌症类型。研究表明，饮食富含异黄酮的食物可以降低许多癌症的发病率和死亡率[1-9]。人体中异黄酮的主要饮食来源是大豆和豆制品，大豆异黄酮的主要结构是以3-苯并吡喃酮为母核的化合物群[10-11]，分为游离型的苷元和结合型的糖苷2种[12-13]。近年来，游离型苷元大豆苷元（daidzein，DAI）的生物活性，特别是抗癌活性引起了人们的极大关注[14-17]。DAI对A549肺癌细胞半数致死量（IC）为32.18 μmol/L[17]。大豆异黄酮在大豆中的含量为0.1%～0.5%，而游离型苷元仅占大豆异黄酮含量的5%～10%，仅仅依靠饮食富含异黄酮的食物抑制癌细胞的生长是不现实的。

基于DAI抗肿瘤活性不足的缺点，本研究旨在对DAI进行结构修饰，以提高其抗肿瘤活性。大豆异黄酮活性具有结构依赖性[11]，从理论上分析，DAI的4′位和7位引入活性基团可以增加活性。因此，在4′位引入卤族元素Cl，在7位引入哌嗪基团，合成大豆异黄酮衍生物4′-氯-7-[2-（哌嗪-l-基）乙氧基]異黄酮（3-（4-chlorophenyl）-7-[2-（piperazin-l-yl）ethoxy]-4H-chromen-4-one，CPEO-43），通过体外细胞实验研究CPEO-43抗肿瘤活性，并建立CPEO-43的超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）分析方法。

1仪器与材料

1.1主要仪器

核磁共振仪WIPM-NMR-400（中科牛津波谱技术有限公司）;酶标仪SpectraMax25 （Molecular Devices）;电子分析天平ME235P（德国Sartorius）;AB Sciex QTRAP 4500液质联用仪（LC-MS，日本岛津）;紫外可见分光光度计UV9100（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）;傅里叶红外光谱仪（德国Bruker）;ACQUITY UPLC色谱仪（美国Waters）。

1.2材料

A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞，河北北方学院药学系实验室保存。

SD雄性大鼠（250 g），购自北京华阜康，饲养温度为（25±2） ℃，湿度为（50±2）% 。

三氟化硼乙醚（批号 RH328089）、五氯化磷（批号 DX6RRR1A PCl），购自安耐吉;间苯二酚（批号 F2002009）、二溴乙烷（批号 F1808053）、4-氯苯乙酸（批号 B1826138），购自阿拉丁;哌嗪（批号 LMB0S39）、碘化钠（批号 LDB0S31），购自百灵威;碳酸钾、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯、石油醚等常规有机试剂，购自天津永大;DMEM 高糖培养基，购自Gibco公司;胎牛血清（FBS），购自ZATA公司;DAI，购自上海源叶生物科技有限公司;MTT试剂盒，购自Solarbio公司。

2实验方法

2.1化合物CPEO-43的合成与表征

2.1.1合成方法

以天然DAI结构（如图1所示）为母核，对4′和7位进行结构优化，增加DAI的抗肿瘤活性。4′位引入Cl能够保证后续取代反应仅发生在7位，防止副反应发生，提高产率。另外，哌嗪是含氮杂环体系中的重要一员，环上的 N 原子可以参与生物体中氢键的形成，增加药物与受体的亲和力和选择性[18]，因此在7位引入哌嗪增加了DAI的生物活性。合成过程中并未以DAI为起始原料，因为直接购买DAI成本较高，若从植物中提取，过程较为繁琐且收率较低[19-20]，且以DAI为原料进行取代反应时，4′位及7位均可能发生取代反应，难以制备单一的4′-氯-7-羟基异黄酮（图2中b），进而影响后续中间产物4′-氯-7-溴乙氧基异黄酮和目标化合物CPEO-43的合成。因此，参照文献[21-22]设计了CPEO-43合成方案，如图2所示。

CPEO-43的合成：对氯苯乙酸在路易斯酸三氟化硼催化下形成C，具备较强的吸电子能力，与富电子基团间苯二酚发生傅克酰基化反应，生成脱氧安息香（图2中a）。化合物a反应溶液在DMF/PCl条件下生成中间产物4′-氯-7-羟基异黄酮（图2中b）。化合物b的酚羟基在碱性条件下生成氧负离子，溴代烷烃与氧负离子发生亲电取代反应，生成4′-氯-7-溴乙氧基异黄酮（图2中c）。再利用碘化钠作为催化剂，与化合物c反应，生成反应活性更强的碘取代物，碱性条件生成C，与哌嗪发生亲核取代反应，生成CPEO-43。使用柱层析方法，采用甲醇-二氯甲烷作为洗脱溶剂梯度洗脱，纯化化合物CPEO-43。具体过程如下。

4′-氯-7-羟基异黄酮的合成：将间苯二酚（10 mmol）和对氯苯乙酸（11 mmol）溶于三氟化硼乙醚（80 mmol）中，于85 ℃条件下磁力搅拌4 h，冷却，缓慢加入DMF（10 mL），生成脱氧安息香（图2中a）。向化合物a反应溶液中加入DMF（20 mL）/PCl（15 mmol）混合溶液，室温搅拌3 h，倒入沸腾的0.1 mol/mL HCl水溶液中，冷却、过滤、干燥得粗产物4′-氯-7-羟基异黄酮，再经乙醇重结晶纯化。

4′-氯-7-溴乙氧基异黄酮的合成：将化合物b（10 mmol）、碳酸钾（25 mmol）、二溴乙烷（52 mmol）加到DMF（50 mL）中。氮气条件下，80 ℃反应3 h，冷却后倒入冰水中，过滤、干燥得到粗产物4′-氯-7-溴乙氧基异黄酮，再经乙醇重结晶纯化。

CPEO-43的合成：将化合物c（10 mmol）、碘化钠（10 mmol）、哌嗪（12 mmol）、碳酸钾（35 mmol）加到DMF（100 mL）中，氮气条件下，60 ℃反应3 h，冷却后倒入冰水中，过滤、干燥得到化合物CPEO-43粗产物，再经二氯甲烷-甲醇梯度洗脱纯化（9∶1～3∶1）。

2.1.2化合物CPEO-43结构鉴定

通过FT-IR，MS，1H- NMR及C-NMR鉴定合成化合物CPEO-43的结构。取适量CPEO-43，加入溴化钾研磨后压片，在400～4 000 cm-1范围内测定红外吸收光谱。称取适量CPEO-43，加入DMSO氘代试剂，进行核磁共振氢谱及碳谱检测。

配制质量浓度约为5 ng/mL的 CPEO-43甲醇溶液，采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测模式（MRM）进行正离子（H）检测;喷雾电压为3 000 V;喷雾温度为500 ℃，m/z385.0→113.1（CPEO-43）进行质谱检测，观察样品溶液在m/z为385.0的离子片段下的吸收峰。

2.2化合物CPEO-43抗肿瘤活性实验

2.2.1细胞培养

A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞用含10% FBS及1% 青霉素-链霉素（penicillin-streptomycin solution，PS）的DMEM高糖培养基，置于37 ℃，5% CO培養箱中培养，每2～3 d用胰酶消化液消化传代。

2.2.2MTT法检测细胞活性

实验分为溶剂组（以DMSO为溶剂）、阳性药对照组（以DAI为阳性对照药）、CPEO-43实验组和空白组（不加细胞，只加培养基）。取对数生长期的A549和HCT116细胞计数后均匀铺于96孔板，每孔8 000细胞，在37 ℃，5% CO细胞培养箱中培养24 h后，按照上述分组给药处理。

除空白组不含细胞外，其余每组加药之前含有相同数量的细胞，溶剂组、阳性药对照组、CPEO-43实验组中含有相同浓度的DMSO，终浓度为0.1%;阳性药对照组DAI终浓度为10 μmol/L;CPEO-43实验组设置8个浓度，CPEO-43终浓度分别为0.01，0.03，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L。细胞给药后于培养箱中培养72 h，吸弃上清，加入90 μL新鲜培养液，加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h，吸弃上清，加入110 μL Formazan溶液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在波长490 nm处测定光密度值（optical density，OD），根据公式计算抑制率。抑制率%=（OD-OD）/（OD-OD）×100%。

2.3化合物CPEO-43的UPLC方法的建立

2.3.1色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱;流动相为甲醇（A）-0.025%（体积分数）甲酸水溶液（B），流速：1 mL/min，柱温：35 ℃，进样量：5 μL。洗脱条件：0～2.5 min，46% A;2.5～8.0 min，46%～52.3% A;8.0～8.5 min，52.3%～59.5% A;8.5～12.0 min，59.5%～73% A;12.0～13.0 min，73%～46% A;13.0～15.0 min，46% A。检测波长：254 nm。

2.3.2标准溶液的配制

精密称取10 mg 化合物CPEO-43，加甲醇溶解，制成1 mg/mL的CPEO-43标准储备液，于-20 ℃下保存备用。临用时，用起始流动相稀释至所需浓度即可。

2.3.3血样采集

大鼠摘眼球取血，将血液采集至抗凝离心管中，摇匀，4 000 r/min离心10 min。

2.3.4血浆样品预处理

取血浆样品100 μL，置于离心管中，再加入900 μL甲醇，涡旋3 min，充分沉淀蛋白，再于4 ℃下以15 000 r/min离心10 min，取上清液，氮气条件下吹干，再用100 μL 50%甲醇水复溶，15 000 r/min离心10 min，取上清液，微孔滤膜过滤，待测。

2.3.5方法学考察

1）专属性考察

分别取大鼠空白血浆和含CPEO-43药物血浆，按“2.3.4”所述方法处理样品，进样分析，记录色谱图，考察血浆中内源性物质是否会干扰被测物质CPEO-43的测定。

2） 线性关系与定量限考察

取空白血浆100 μL，加入不同浓度的化合物CPEO-43，按“2.3.4”所述方法处理，制备CPEO-43标准系列溶液，按照上述色谱条件进样分析，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。以信噪比10对应的CPEO-43浓度确定方法定量限。

3）准确度和精密度考察

参照《中华人民共和国药典》2020版第4部生物样品定量分析方法验证指导原则（以下简称指导原则）[23]，配制定量下限0.5 μg/mL及低（1.00 μg/mL）、中（4.00 μg/mL）和高浓度（7.50 μg/mL）质控样品，每个浓度5个样本。按照上述色谱条件进样，连续测定3 d。准确度以测定值与质控样品标示值的差值表示，差值控制在±15%之内，定量下限准确度应在标示值的±20%范围内。同一批内低、中、高浓度的日内精密度的标准偏差RSD值和不同批的低、中、高浓度的日间精密度的RSD值均不得超过15%，定量下限的RSD值均不得超过20%。

4）提取回收率实验考察

取空白血浆100 μL，加入适量的化合物CPEO-43，按“2.3.4”项方法处理，制成终浓度分别为0.5，4.0，10.0 μg/mL的CPEO-43血浆样品，每个浓度平行制备5份，进样分析，记录峰面积A1;另取空白血浆，按“2.3.4”项方法处理。准确移取取上清液，加入适量化合物CPEO-43，使终浓度分别为0.5，4.0，10.0 μg/mL，旋涡混匀，氮气吹干。然后，加入100 μL 起始流动相复溶，微孔滤膜过滤，进样分析，记录峰面积A2。以A1与A2的比值进行回收率计算。

5）稳定性考察

参照3）方法制备定量下限0.5 μg/mL及低（1.00 μg/mL）、中（4.00 μg/mL）和高浓度（7.50 μg/mL）质控样品，分别于室温下放置8 h，4 ℃保存3 d和-20 ℃保存10 d，在上述色谱条件下检测，考察样品的稳定性。含量与初始值的偏差不得超过±15%。

2.4统计分析方法

用GraphPad Prism v8.0.2.263，计量资料数据以均数±标准差表示，计数资料以百分率表示，p<0.05为差异有统计学意义。

3结果与分析

3.1化合物CPEO-43的合成与表征

目标化合物的合成分为3步：1）间苯二酚和对氯苯乙酸在三氟化硼乙醚作用下生成脱氧安息香（a）;2）a溶液在DMF/PCl催化下完成增碳反应生成中间产物b，产率为50%;3）化合物b在碱性条件下完成烷烃取代反应得到中间体c，产率为61%。化合物c与哌嗪反应得到含有哌嗪和异黄酮结构的化合物CPEO-43，产率为54%，总产率为 16.5%

CPEO-43制备过程中，中间产物b和c利用乙醇进行重结晶能够有效提纯，方法简单。但终产物CPEO-43通过乙醇重结晶后，产物混有杂质，结合终产物与其他杂质极性大小的差异，选择甲醇-二氯甲烷作为流动相进行梯度洗脱，可实现产物与杂质的有效分离。

利用FT-IR鉴定化合物CPEO-43的官能团。如图3所示，化合物CPEO-43主要吸收峰如下：3 424 cm为NH的伸缩振动，1 627 cm为C=O的伸缩振动，1 335 cm为C-N伸缩振动，1 257 cm为=C-O-C伸缩振动，1 371 cm和1 201 cm为苯环的骨架振动产生的吸收峰，1 044，954，882，826 cm为苯环上的=C-H的弯曲振动所产生。

MS，H-NMR及C-NMR对化合物CPEO-43结构鉴定结果为：MS （CIHONCl）：385 （M+H）+。1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ 8.51（s，1H），8.01（d，J= 8.8 Hz，1H），7.62（d，J = 8.0 Hz，2H），7.49（d，J = 7.9 Hz，2H），7.20（s，1H），7.09（d，J = 8.9 Hz，1H），4.22（s，2H），2.68（s，6H），2.40（s，4H），1.21（s，1H）。13C-NMR（101 MHz，DMSO）δ 154.90（C-2），122.95（C-3），174.67（C-4），127.35（C-5），115.76（C-6），163.53（C-7），101.64（C-8），157.87（C-9），117.90（C-10），131.30（C-1′），131.09（C-2′，6′），128.61（C-3′，5′），133.01（C-4′），66.82（C-1′′），54.81（C-2′′）， 57.54（C-2′′′，6′′′）， 45.90（C-3′′′，5′′′）。

3.2化合物CPEO-43對癌细胞存活率的影响

如图4和图5所示，与溶剂对照组相比，DAI对A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞具有抑制作用，然而抑制率较低，结构优化后，CPEO-43对癌细胞的抑制作用显著增加。

由图4和图5可知，10 μmol/L DAI对A549肺癌和HCT116结肠癌细胞的抑制率分别为4.421%和5.601%;而相同浓度新合成的化合物CPEO-43对A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞抑制率分别为58.43%和72.03%，该浓度下化合物CPEO-43对A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞抑制率分别是DAI的13.2倍和12.9倍。表明化合物CPEO-43能够显著抑制A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞生长，IC值分别为2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。

3.3化合物CPEO-43色谱分析专属性结果

如图6和图7所示，化合物CPEO-43的保留时间为8.2 min，峰形良好，无血浆杂质干扰。

3.4线性关系与定量限

以质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归： y=21 403x+356.08（R=0.999 9）。线性范围：0.5～10 μg/mL。利用信号噪音比值法确定定量限，信噪比为10时样品质量浓度为0.5 μg/mL。

3.5准确度和精密度

本方法的CPEO-43定量下限、低、中、高血浆样品的日内精密度和日间精密度RSD值分别为8.19%，3.27%，0.53%，0.53%和8.91%，5.90%，4.22%，2.35%，均小于《中华人民共和国药典》指导原则的15%。实测值与质控样本标示值的差值亦符合指导原则方法验证的要求。结果表明，本方法的准确度和精密度能够满足CPEO-43的分析要求。

3.6回收率實验结果与分析

如表1所示，低、中、高3种质控浓度的样品的提取回收率在92%～100%，RSD值均小于5%，回收率满足分析要求。

3.7稳定性

将化合物CPEO-43低、中、高3个浓度质控样品于室温下放置8 h，4 ℃保存3 d和-20 ℃保存10 d后实验测得的各个浓度的含量与初始值相差均不超过10%，符合指导原则不超过±15%的要求，这表明该方法制备的样品在上述条件下是稳定的。

4结语

准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂的研发非常重要。本研究基于CPEO-43良好的抗肿瘤效果，建立了CPEO-43血浆样本的UPLC-UV分析方法。

甲醇和乙腈是液相色谱最常用的流动相试剂，甲酸、乙酸、三氟乙酸常作为调节剂来改善色谱峰形。选择甲醇-水-甲酸进行分析尝试，结果发现，流动相中含有甲酸后，能够降低色谱流出曲线的标准差，色谱结果更好。本研究考察了不同浓度甲酸对色谱峰形和保留时间的影响。甲酸体积比分别为0.1%，0.05%，0.025%时，CPEO-43 的峰形无明显变化，随着甲酸酸度的降低，保留时间由7.8 min延长到8.2 min。考虑酸度对色谱柱寿命的影响，因此选择0.025%的甲酸作为流动相进行色谱分析。

本研究所建立的UPLC分析方法在0.5～10.0 μg/mL线性关系良好，其准确度、精密度和稳定性均能满足要求。方法的定量限为0.5 μg/mL，CPEO-43能抑制A549肺癌细胞和HCT116结肠癌细胞生长，IC值分别为2.51 μmol/L和0.87 μmol/L。因此该分析方法的定量下限值能满足定量分析有效抗肿瘤药物浓度，可为药物临床检测提供方法基础。

本研究针对DAI抗肿瘤活性低的缺陷，在DAI的4′位引入卤族元素Cl，在7位引入哌嗪基团，进行结构修饰，成功全合成了CPEO-43，并显著提高了DAI抗肿瘤活性。但是，合成CPEO-43的工艺条件仍有待进一步优化，CPEO-43的抗肿瘤机制有待更为深入的研究。

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