纳米材料在食品安全多残留免疫层析检测中的应用*

黄佳佳，张燕姬，曾宝钿，刘颖谊，洪日韦婷，翟 培

(广东食品药品职业学院，广东 广州 510520)

食品安全与国民经济和人民生活水平密切联系，快速检测技术在推进我国食品安全整治过程中发挥着重要作用，而该领域也逐步朝着标准化方向发展[1]。20世纪80年代，免疫层析技术(Immunochromatographic Assay，ICA)以其简单、快速、灵敏等优势而被广泛应用于食品安全、环境和医疗诊断领域[2]。免疫层析试纸条一般由样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸和PVC底板构成(图1)。其核心原理是基于抗原-抗体的特异性结合，将捕获抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上，采用有色或发光纳米颗粒标记抗体作为信号标记物，通过样品溶液层析泳动，即可在反应区域实现快速显色，从而实现对目标分析物的定性或定量分析[3]。在食品安全检测领域，基于双抗夹心法和竞争法的ICA现已被广泛应用于大分子蛋白质和小分子有毒有害的检测[4]。本文旨在归纳目前纳米材料在食品安全多残留ICA的应用情况，并对ICA未来发展进行展望。

图1 免疫层析试纸条构造和检测原理Fig.1 Structure and principle of immunochromatographic test strip

1 纳米材料在免疫层析技术中的应用

胶体金(gold nanoparticles，GNPs)是免疫层析技术的传统标记物，具有制备简单、容易标记、稳定性高等特点，但是胶体金本身不具备发光特性，光学信号低，使得检测灵敏度较低，从而限制了胶体金在低检出限项目中的应用[5]。为进一步提高灵敏度，基于不同功能性纳米颗粒标记物的ICA被开发利用，主要可分为有色纳米颗粒、发光纳米颗粒、磁性纳米颗粒和其他新型标记材料[6]。

1.1 有色纳米颗粒

有色纳米颗粒包括金纳米花(gold nanoflowers，AuNFs)、乳胶微球(latex microspheres，LMs)、碳纳米颗粒(carbon nanoparticles，CNPs)和胶体硒纳米颗粒(colloidal selenium nanoparticles，SNPs)等。金纳米花具有多分支结构和比表面积大的优势，与检测对象结合亲和力增强，检测灵敏度提高。金玉等[7]分别合成了球状胶体金和金纳米花作为标记探针，检测牛奶中的黄曲霉毒素M1，结果显示金纳米花作为标记物的免疫层析试纸条检测限为12.3 pg/mL，比传统球型胶体金标记物灵敏度提高了5倍左右。CNPs是一种无定形的黑色粉末，局部石墨化结构，具有稳定性高、易制备、价格低廉等优点。Liu等[8]开发了CNPs作为标记探针的试纸条，检测肉类样品中沙丁胺醇，检测限低至10 μg/kg，且试纸条稳定性高于胶体金(GNPs)标记试纸条，制备成本更低。胶体硒纳米颗粒SNPs是一种铁锈色的纳米微粒，具有很好的生物吸附性能，与蛋白标记简单且不容易发生沉聚。Wang等[9]以SDS和PEG为稳定剂，在常温下成功制备了SNPs，开发了基于SNPs的试纸条检测猪尿中的克伦特罗，检测限为3 ng/mL，与市售的同类试纸条具有相同的灵敏度，但稳定性更高，可在37 ℃下储存60天。

1.2 发光纳米颗粒

发光纳米颗粒包括量子点(quantum dots，QDs)，荧光微球(fluorescent microspheres，FMs)，时间分辨荧光微球(time-resolved fluorescent microspheres，TRFMs)，上转换发光颗粒(UP-converting phosphor，UCP)等。量子点是一种光学稳定性高，发射带窄，吸收光谱宽的荧光半导体纳米晶体，因其独特的光学性质，被认为是应用前景最广的生物标记材料。Liu等[10]利用量子点作为标记探针研发了检测农产品中啶虫脒的免疫层析试纸条，定性检测限为1 ng/mL，结合便携式荧光测定仪检测，其线性范围为0.098～25 ng/mL，最高半抑制浓度(IC50)为1.12 ng/mL，样品平均回收率为78.38%～126.97%，盲样检测结果与高效液相色谱-串联质谱检测结果高度相关。Zhao等[11]开发了一种基于竞争性上转换荧光免疫层析检测谷物和其它农作物中的黄曲霉毒素B1污染水平，检测限为0.1～5 ng/g，远低于目前我国国家标准中农作物黄曲霉毒素B1最大残留限量，可满足现行检测需求。

1.3 磁性纳米颗粒

磁珠纳米颗粒(magnetite nanoparticles，MNPs)常被用来从食物基质中浓缩和分离目标分析物。用这种方法制备样品，可消除食品基质对检测结果的影响，提高检测灵敏度。Li等[12]将磁性纳米颗粒与抗体偶联，制备免疫磁珠，用于富集分离出牛肉、牛奶和水样中的大肠杆菌O157：H7并富集，结合荧光微球试纸条检测，其灵敏度比非磁富集样品方法提高了33倍。为进一步提高检测性能，Yan等[13]提出了一种基于磁纳米颗粒标记得双探针信号放大策略，利用MNPs标记小鼠单克隆抗体和MNPs标记羊抗鼠抗体之间的高亲和力，通过生成双探针网络复合物来获得扩增信号，该方法实现3-氨基-2-恶唑烷酮的高灵敏度检测，检出限为0.044 ng/mL。

1.4 其他新型标记材料

1.4.1 纳米酶颗粒

纳米酶具有类酶特性，作为天然酶的直接替代品，提高了检测方法灵敏度，在生物传感器领域具有巨大应用潜力。Wei等[14]利用基于金Au@Pt纳米酶的新型ICA对牛奶中链霉素进行检测，与传统胶体金ICA相比，其灵敏度提高了80倍。Yang等[15]合成了催化效率高、稳定性好的铂铱纳米材料(Pt-Ir NCs)，该研究比较了Pt-Ir NCs-ICA和底物AEC介导增强的 Pt-Ir NCs-ICA，结果显示Pt-Ir NCs-ICA的检测限为0.5 ng/mL，而ACE介导增强的Pt-Ir NCs-ICA检测限达到0.05 ng/mL，灵敏度提升一个数量级。

1.4.2 双重信号标记材料

大部分多残留ICA是基于几种多色标记载体，用于单独抗体标记，虽然该策略丰富了信号输出，但检测系统也变得更复杂，甚至多种标记材料之间会产生诸多干扰。因此，开发灵敏、方便快捷的双读出策略将是一个巨大的挑战[16-17]。Wang等[18]采用简单一步法制备鲁米诺还原金纳米颗粒(AuNPs)，分别以AuNPs比色信号和化学发光信号作为定性输出。单探针双读出技术具有分析效率高、成本低、操作方便、准确度高等优点，在药物安全、环境卫生和临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

1.4.3 金属有机框架

金属有机框架(MOFs)凭借其高度生物亲和力以及新颖的拓扑结构在在分离、催化、传感、生物医药等方面有着广泛的应用[19]。普鲁士蓝(PBNPs)是MOFs材料中的一种，这种基于MOFs材料的ICA分析在灵敏度和稳定性方面发挥强大的优越性，Zhao等[20]首次以PBNPs为标记材料，应用于克伦特罗的ICA分析。在最佳条件下，基于PBNPs的ICA测定克伦特罗线性范围为0.5～5 ng/mL，检测限为1.0 ng/mL，灵敏度比传统的金纳米粒子ICA提高了5倍。

2 多残留ICA在食品安全中的应用

食品及农产品在生产、加工、包装、运输、储存过程中，有害化合物混合污染联合效应广泛存在[21-22]，单个农产品中同时检出多种药物残留的现象较为普遍[23]。较多的研究只关注单一毒性效应，忽视了混合污染带来的危害风险。因此，开发多残留免疫层析方法更适用食品安全现场快速检测的需求。

2.1 食源性微生物

全球每年多达30%的人口患食源性疾病，其中食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因[24]。Zheng等[25]开发了一种基于硅量子点(QDs)的荧光ICA，用于同时鉴定食品中寒沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7，在双通道ICA条带中，QDs提供优越的荧光信号，且具有单分散性和良好稳定性；而该方法对沙门氏菌和大肠杆菌的检出限均能达到50 CFU/mL，与传统方法(GNPs-ICA)相比，灵敏度提高了200倍(图2)。Wang等[26]把等温DNA扩增技术与ICA联合，将扩增的沙门氏菌和大肠杆菌DNA分别与乳胶微球(LMs)进行标记，该方法对两种细菌的检测限达到100 CFU/mL。

图2 量子点双通道免疫层析[25]Fig.2 Dual channel of quantum dot immunochromatography assay

2.2 真菌毒素

农产品在贮藏、运输和加工过程容易受真菌侵染。而由真菌代谢所产生的真菌毒素对食品及农产品的污染降低产品质量，引发了严峻的食品安全问题[27]。Liu等[28]建立了一种基于智能手机的定量双检测模式装置(图3)，集成了胶体金和时间分辨荧光微球免疫层析，用于检测谷物中多种真菌毒素；两种方法对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素和伏马毒素B1检测限分别为0.59/0.24/0.32/0.9/0.27 μg/kg、0.42/0.10/0.05/0.75/0.04 μg/kg。双检测模式为真菌毒素高通量、高灵敏度的现场检测提供有力支撑。此外，Goryacheva等[29]为了在亲水介质和生物偶联过程中保持量子点的高荧光量子产率，合成CdSe/CdS和CdSe/CdS/ZnS核壳异质结构，并用不同表面组成的二氧化硅涂层扩展它们，使荧光量子产率在水介质中保持高达70%；将表面含有环氧和羧基的硅烷化量子点与单克隆抗体进行生物偶联，开发多色荧光ICA，用于同时检测玉米和小麦中的玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。

图3 真菌毒素多残留免疫层析方法[28]Fig.3 The immunochromatographic assayfor multiple mycotoxin

2.3 兽药及违禁药

在畜牧业的发展过程中，兽药的使用可提高禽畜产品质量，然而也导致动物源性食品的兽药残留。为此，Hendrickson[30]建立了一种快速、灵敏的GNPs-ICA，用于牛奶中环丙沙星和氯霉素的同时检测。该方法样品前处理简单，对于两种药物的检测限分别是20 pg/mL和0.5 ng/mL。Liu等[31]建立了磁性普鲁士蓝纳米酶(MPBN)介导的双读数的多残留ICA(图4)，以显色底物TMB催化氧化产生的催化信号和探针原始颜色的比色信号为基础，这种双信号输出策略不仅提高了检测精度，且方法重现性好，对莱克多巴胺和克伦特罗加样回收率为84.01%～119.94%。

图4 基于磁性普鲁士蓝纳米酶的多残留免疫层析方法Fig.4 Multiplex lateral flow immunoassay based on magnetic Prussian blue nanoenzyme

2.4 农 药

化学防治是农作物保护的重要手段之一，但农药残留带来的危害不容忽视。Zou等[32]建立了一种基于上转化纳米颗粒(UCPs)的快速、灵敏的ICA方法，用于三种有机磷农药的多残留检测。优化后的UCPs-ICA针对对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的IC50分别为3.44 ng/mL、3.98 ng/mL和12.49 ng/mL，检测范围为0.98～250 ng/mL，添加回收率为67%～120%，该方法可作为快速检测食品中3种有机磷农药的替代筛选工具。Sheng等[33]制备了基于表面增强拉曼散射(SERS)的试纸条，同时检测百菌清、吡虫啉和氧氟芬三种农药，该方法通过测定纸条检测线上SERS信号的强度，实现准确定量分析。

表1 免疫层析技术在食品各领域的应用Table 1 Application of immunochromatographic assay in various field of food

续表1

3 结 语

食品安全关系人民健康和社会稳定。免疫层析技术在食品安全现场监控中发挥着不可替代的作用，为食品安全快速检测提供了有效保障。

各种纳米材料的应用为ICA带来新的活力，与传统的胶体金免疫层析相比，其灵敏度和稳定性等方面得到较大得提升。多残留免疫层析可同时进行多对象检测，具有样品用量少，检测时间短，检测灵敏度高等方面优点。在未来的研究当中，高通量检测可通过借助于精密的试剂分配技术，如喷墨印刷技术[39-40]实现。同时，蜡印技术的兴起为构建多通道免疫层析提供了一种新的手段。然而高通量的ICA往往存在一定的交叉反应。为解决这一问题，一方面可制备高特异性的抗体避免交叉影响，或开发具有广谱性的抗体同时检测多种有害分子，另一方面以新型识别分子(如适配体)来代替抗体[41]。此外，通过将智能手机的光学成像系统与免疫层析技术深度融合，可提高分析性能。智能成像的引入使检测准确性明显提高，但是目前基于智能手机的免疫层析方法多数针对单一目标物的分析，在高通量定量检测方面仍有待提升。

综上，免疫层析技术在多年发展中得到不断完善，它是未来快速检测方法中最具发展前景的工具，具有简单、便携、易用、经济的特点，是食品安全快速检测不可或缺的工具。