固态发酵黑姜挥发性物质的GC-MS测定

王丽媛，周宁，宁月宝

(内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010)

生姜是一种药食同源的植物，在很多地区作为一种常用的烹饪调味品，用来去除食物中的膻腥味，增加鲜味，提高食物风味[1-2]。生姜主要的活性成分是姜辣素，除此之外，还含有多种功能性物质，如姜烯酚和姜酮等酚类物质、嘌呤类化合物、抗氧化酶、姜油及多糖类、糖蛋白和黄酮类物质[3-4]。生姜中含量最高的姜酚是姜辣素，其中大部分是6-姜辣素，其含量占总姜辣素的75%左右[5]。生姜具有抗肿瘤[6-7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]、保护心血管[11-12]、抗骨关节炎[13]以及抑制癌细胞活性等作用。生姜中的8-姜酚和10-姜酚对各种肿瘤细胞的活性都具有很好的抑制作用[14]。

生姜通过恒温恒湿箱按照规定的条件(温度(68.0±1.0) ℃，湿度(95.0±1.0))，发酵30 d得到一种黑色物质，称为发酵黑姜[15]。发酵黑姜的营养成分显著升高，辛辣气味减少，是一种天然健康的保健食品[16]。发酵过程主要发生了美拉德反应[17]。本实验采用同时蒸馏萃取法分别提取发酵黑姜与烘干姜中的挥发性成分并进行对比分析，通过GC-MS分析，确定了发酵黑姜与烘干姜的化学组成和相对百分含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

新鲜生姜：购自包头市昆都仑区友谊菜市场；昆明种小鼠：购自内蒙古大学实验动物中心。

1.1.2 试剂

二氯甲烷(CH2Cl2)、氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na2SO4)：国产分析纯，天津市风船化学试剂三厂；四氧嘧啶(C4H2N2O4)：浙江中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.3 仪器

FA2104B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；FTT-800C型多功能粉碎机 东莞市房太电器有限公司；QYZL-6B型同时蒸馏萃取装置 上海乔跃电子科技有限公司；DZKW型恒温水浴锅 余姚市亚星仪器仪表有限公司；KDM500型控温电热套 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；RE52CS-2型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Agilent 7890A-5975C GC-MS气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；YZB/湘 0043-2012血糖仪 三诺生物传感股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生姜的发酵

将恒温恒湿箱的湿度调在95%，温度控制在68 ℃，再把新鲜生姜放入恒温恒湿箱中，发酵30 d后生姜发生美拉德反应颜色变黑，辛辣气味挥发消失，得到发酵黑姜。

1.2.2 发酵黑姜的挥发物提取(SDE法)

操作SDE之前，在同时蒸馏萃取装置的两端同时加入二氯甲烷(30 mL)和超纯水(350 mL)蒸馏2 h，清洗同时蒸馏萃取装置以保证仪器洁净。将发酵黑姜和烘干姜干燥好后用粉碎机打成粉末，分别称取发酵黑姜和烘干姜样品30 g(精确至1 mg)后把样品放入烧杯中，加入适量的超纯水和氯化钠(NaCl分析纯)溶解后把溶液倒入1000 mL的圆底烧瓶中，加入适量的沸石和超纯水，再接上同时蒸馏萃取仪的一端用控温电热套加热至微沸。取出圆底烧瓶(50 mL)，里面加入一些沸石和二氯甲烷(30 mL)，浸泡在恒温水浴锅(55 ℃)中，连续蒸馏萃取2 h。为保证实验的精准性，滴下溶剂的速度控制在5 s/滴左右。萃取完成后，把同时蒸馏萃取仪冷却至室温后再把仪器拆开，并把仪器中的有机溶剂和烧瓶中的萃取液合并到一起。在低温冰柜(条件：-40 ℃)中冷冻过夜，再把残留的水用无水硫酸钠(Na2SO4分析纯)除去，把溶剂用旋转蒸发仪挥发，最后把提取物浓缩至1 mL(放入色谱瓶)进行GC-MS分析[18]。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：He，1.0 mL/min；升温程序：柱初始温度为50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min的速率升温至220 ℃；进样口的温度为250 ℃；进样方式：分流进样，分流比是4∶1；进样量是1 μL。

质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV；电子倍增器电压1635 V；质量扫描范围30～450 amu，离子源温度230 ℃；传输线温度240 ℃；四极杆温度150 ℃。

1.2.4 姜辣素对小鼠的降血糖作用

将小鼠随机分成两组，对照组10只，实验组20只，称平均体重。给实验组小鼠的腹腔注射20 mg/kg的四氧嘧啶溶液，建立小鼠糖尿病模型。对照组的小鼠注射同等剂量的生理盐水。通过血糖仪检测小鼠的血糖浓度，将高于7.0 mmol/L 的小鼠归为高血糖小鼠，高血糖小鼠按照血糖高低再分为中高血糖组(13.78 mmol/L)和高血糖组(27.97 mmol/L)两组。用黑姜姜辣素给实验组小鼠连续灌胃28 d，给姜辣素400 mg/kg，在给小鼠灌胃的第14天和第28天，禁食12 h以后，测量其血糖值。

2 结果分析

2.1 同时蒸馏萃取法发酵黑姜的测定结果

发酵黑姜中挥发性成分的GC-MS总离子流图见图1。使用专业分析软件(Shimadzu GC-MS solution Release 2.10)对总离子流进行分析，分析结果得到361种化合物。化合物各组中的相对峰要按照面积归一法计算百分比含量[19]。根据所得到的质谱信息可鉴定成分，使用谱库检索数据实行检索。通过与标准图谱相对比，进行化学结构的确认。其中鉴定出了16种化合物，占总含量的27.81%。

图1 发酵黑姜中挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in fermented black ginger

通过对发酵黑姜挥发性物质的化学成分进行GC-MS分析鉴定出了姜辣素，主要相对总含量：β-红没药烯(12.89%)和金合欢烯(11.57%)，见表1。其中还鉴定出了22种硫醚类化合物，其中硫醚类化合物总含量为0.24%，硫醚类化合物见表2。

表1 发酵黑姜中挥发性成分鉴定结果Table 1 Identification results of volatile components in fermented black ginger

表2 发酵黑姜挥发性物质中含有的硫醚类化合物Table 2 Thioether compounds contained in volatile substances of fermented black ginger

续 表

2.2 同时蒸馏萃取法烘干姜的测定结果

烘干姜中挥发性物质的总离子流图见图2。

图2 烘干姜中挥发性成分的总离子流图Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in dried ginger

通过对烘干姜挥发性物质的化学成分进行GC-MS分析，鉴定出了14种化合物，占总含量的24.23%。其挥发性成分主要由β-红没药烯(6.3%)和β-姜黄素(3.95%)组成，其相对总含量为10.25%，见表3。其中还鉴定出了7种硫醚类化合物，其中硫醚类化合物总含量为0.24%，见表4。

表3 烘干姜中挥发性成分鉴定结果Table 3 Identification results of volatile components in dried ginger

表4 烘干姜挥发性物质中含有的硫醚类化合物Table 4 Thioether compounds contained in volatile substances of dried ginger

续 表

为了更直观地对发酵黑姜与烘干姜做对比，现将发酵黑姜与烘干姜主要挥发性物质进行对比总结，结果见表5。

表5 发酵黑姜与烘干姜主要挥发性物质对比Table 5 Comparison of main volatile compounds between fermented black ginger and dried ginger %

2.3 姜辣素对小鼠降血糖作用的测定结果

高血糖组小鼠灌胃后血糖值与灌胃前相比，血糖下降率为71%，中高血糖值组小鼠灌胃后血糖值与灌胃前相比，血糖下降率为52.44%。结果表明，黑姜姜辣素对小鼠具有很好的降血糖作用(见表6)。

表6 黑姜姜辣素对小鼠血糖的影响Table 6 Effect of gingerol in black ginger on blood glucose of mice

3 结论

以上数据结果显示，发酵黑姜的挥发性成分中β-红没药烯为12.89%，金合欢烯为11.57%，这两种成分都属于姜辣素，而烘干姜的挥发性成分中β-红没药烯仅为6.3%，且并没有发现金合欢烯的存在。经过GC-MS分析结果发现，发酵黑姜的姜辣素中β-红没药烯比烘干姜中含有的β-红没药烯提高了2.04倍，发酵黑姜的姜辣素比烘干姜的姜辣素提高了3.88倍，发酵黑姜的姜辣素含量明显升高，并且通过实验发现，姜辣素可以显著降低小鼠的血糖值，因此，发酵黑姜的降血糖效果比烘干姜的降血糖效果更显著。