超声辅助提取迷迭香抗氧化剂工艺优化及抗氧化活性研究

邓慧，王莹，曾祥辉，王瑛，杨梦男

(邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)为双叶子植物，是唇形科迷迭香属的常绿小灌木，原产于欧洲、地中海沿岸[1-2]。迷迭香富含多种化学成分，鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚和迷迭香酸是迷迭香主要的活性物质[3-5]，据报道，迷迭香有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[6-8]。

目前植物抗氧化成分提取方法主要有回流法、溶剂提取法、超声波辅助法、微波辅助法、超临界流体萃取法等[9-15]，针对迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂的研究鲜有报道。本文采用单因素及响应面试验，在超声辅助提取条件下，分别确定迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂的最佳提取工艺条件；通过DPPH、ABTS+自由基清除率及铁还原力，并以Vc为阳性对照评价其体外抗氧化能力，以期为开发新型天然脂溶性、水溶性抗氧化剂的研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

迷迭香：由湖南省邵东市迷迭香种植基地提供，干叶经低温烘干、粉碎、过40目筛备用。

乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；磷酸(色谱纯)；鼠尾草酸标准品、迷迭香酸标准品：HPLC纯度≥98%，大连美仑生物技术有限公司；DPPH：纯度≥97%，酷尔化学科技(北京)有限公司；ABTS：纯度≥98%，哈尔滨如吉科技有限公司；乙醇、过硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸等：均为分析纯。

FW高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；CP114分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；TD4台式离心机 湖南赫西仪器设备有限公司；U3000高效液相色谱仪 ThermoFisher Scientific公司；SB-700DTY超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；H2-16K真空冷冻干燥器 重庆市松朗电子仪器有限公司；DZKW-4恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 迷迭香提取液的制备

迷迭香粉末按一定料液比加入一定浓度的乙醇溶剂，在一定温度下提取一定时间，经10000 r/min离心15 min，取上清液定容。

1.2.2 脂溶性抗氧化剂测定

参照文献[16]，采用高效液相色谱法测定迷迭香脂溶性抗氧化剂总得率，按下式计算得率(Y1)：

式中：C1为鼠尾草酸含量，mg/mL；C2为鼠尾草酚含量，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为试样质量，mg。

1.2.3 水溶性抗氧化剂测定

参照GB 1886.172-2016，采用高相液相色谱法测定迷迭香水溶性抗氧化剂得率，按下式计算得率(Y2)：

式中：C为迷迭香酸含量，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为试样质量，mg。

1.2.4 单因素试验

称取迷迭香粉末，根据参考文献[17]，超声功率为210 W，以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度为因变量，分别对迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂得率进行单因素试验。

1.2.5 响应面优化试验

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计对迷迭香脂溶性和水溶性抗氧化剂含量提取条件进行优化，以乙醇浓度、料液比、提取时间及提取温度为自变量，以抗氧化剂含量为响应值，设计四因素三水平的优化试验，试验因素与水平设计见表1和表2。

表1 脂溶性抗氧化剂提取试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of fat-soluble antioxidant extraction test design

表2 水溶性抗氧化剂提取试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of water-soluble antioxidant extraction test design

1.2.6 迷迭香粗提取物体外抗氧化性能的测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[18]略有改动，取不同质量浓度的样液和0.1 mmol/L DPPH-乙醇均匀混合，室温下避光反应后，于517 nm处测定吸光度，以Vc为阳性对照，根据下式计算自由基清除率：

式中：A为样品液吸光度；A0为空白吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力的测定

参照文献[19]并稍作改动，取不同质量浓度的样液，加入ABTS+工作液，混合摇匀。室温条件反应后，于734 nm处测定吸光度，以Vc为阳性对照，根据下式计算自由基清除率：

式中：A为样品液吸光度；A0为空白吸光度。

1.2.6.3 铁还原力测定

参照文献[20]并稍作改动，取不同质量浓度的样液，加入磷酸缓冲溶液(pH 6.6，0.2 mol/L)和1%铁氰化钾溶液，混合均匀水浴20 min，冷却后加入10%三氯乙酸溶液，离心10 min，吸取上清液加入0.1%三氯化铁，于700 nm处测定吸光度，以Vc作为阳性对照，用吸光度值表示还原能力。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次，并利用Origin 2018和Design-Expert 10.0.7、Prism 8.0数据软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

在迷迭香脂溶性、水溶性乙醇体积分数分别为80%、40%，料液比为1∶30，提取时间为50 min，提取温度为50 ℃的条件下，结果见图1。

a

b

c

d

由图1中a可知，随着乙醇浓度的增大，迷迭香抗氧化剂得率先增大后减小，可能是乙醇浓度的增加增强了细胞的穿透力，促进了溶剂渗透，从而提高了得率。迷迭香脂溶性抗氧化剂在乙醇浓度为60%时达到最大值，乙醇浓度过高导致渗透压过高，影响植物组织中脂溶性物质的溶出。而迷迭香水溶性抗氧化剂在40%时达到最大值，可能是溶剂极性下降，使水溶性抗氧化剂溶出减少，醇溶性的杂质溶出增多，影响其得率。综合考虑，脂溶性抗氧化剂选用60%乙醇体积分数，水溶性抗氧化剂选用40%乙醇体积分数。

由图1中b可知，迷迭香抗氧化剂得率随着料液比的增加而不断升高。增大迷迭香与提取溶剂的接触面积，有利于迷迭香抗氧化物质溶出。但当料液比达到1∶30后抗氧化剂得率缓慢下降，表明提取已趋于稳定。而料液比过大，后续浓缩耗能加大。从降低成本、节约能源角度考虑，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂的料液比均选用1∶30。

由图1中c可知，迷迭香抗氧化剂得率随着提取时间的延长呈现先升后降的趋势，当提取时间达到50 min时，迷迭香抗氧化剂得率达到最大。但再延长提取时间，迷迭香抗氧化剂得率下降，抗氧化成分可能已被提取出来，过长时间的加热提取使抗氧化成分结构遭到破坏，发生降解，从而导致得率下降；此外，长时间提取会造成一定的资源浪费，故迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂均选取提取时间为50 min。

由图1中d可知，随着提取温度的升高，迷迭香抗氧化剂得率逐渐升高，温度升高可能会加快分子间的运动速度，使细胞壁的渗透性增强，增加迷迭香抗氧化剂的溶出，从而提高得率。脂溶性抗氧化剂得率在50 ℃时达到最大值，而水溶性抗氧化剂得率在60 ℃时达到最大值。当温度继续升高，迷迭香抗氧化剂得率开始降低，在高温条件下分子结构可能发生变化，加速物质氧化及降解，导致迷迭香抗氧化剂得率降低。因此，脂溶性抗氧化剂选用提取温度为50 ℃，水溶性抗氧化剂选用温度为60 ℃。

2.2 响应面试验设计与结果及方差分析

根据单因素试验结果，分别以脂溶性、水溶性抗氧化剂得率为响应值，选取乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素为评价因素，设计四因素三水平的响应面优化试验，试验测定结果见表3。

表3 响应面试验设计方案及结果Table 3 Response surface experiment design scheme and results

续 表

2.2.1 模拟方差分析剂响应面试验结果

对表3中试验数据进行拟合，迷迭香脂溶性抗氧化剂得率的回归多元方程为Y1=5.39+0.11A+0.13B+0.13C-0.078D+0.023AB+0.2AC+0.083AD+0.13BC-0.037BD+0.11CD-0.82A2-0.41B2-0.77C2-0.24D2。

迷迭香水溶性抗氧化剂得率的回归多元方程为：Y2=0.76+0.018A+0.003167B+0.018C+0.003667D+0.012AB-0.019AC-0.022AD-0.009BC+0.012BD-0.0015CD-0.098A2-0.057B2-0.071C2-0.047D2。

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equations

续 表

由表4可知，迷迭香脂溶性抗氧化剂得率模型回归具有高度的显著性(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.0865>0.05)，其决定系数R2=0.9929，校正决定系数R2=0.9858，说明该模型拟合度高，可利用此回归方程预测迷迭香脂溶性抗氧化剂的最佳提取工艺。模型中A、B、C、D、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2差异极显著，AD差异较显著，其余项差异均不显著，根据F值可知，4个因素对得率的影响程度为料液比(B)>提取时间(C)>乙醇浓度(A)>提取温度(D)。

迷迭香水溶性抗氧化剂得率回归模型具有高度的显著性(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.5036>0.05)，其决定系数R2=0.9943，校正决定系数R2=0.9886，表明该模型拟合度高。模型中A、C、AB、AC、AD、A2、B2、C2、D2差异极显著，BC差异较显著，其余项差异均不显著。可利用此回归方程预测迷迭香水溶性抗氧化剂的最佳提取工艺。根据F值可知，4个因素对水溶性抗氧化剂得率的影响程度为乙醇浓度(A)>提取时间(C)>提取温度(D)>料液比(B)。

2.2.2 提取工艺优化及验证试验

通过Design-Expert 10.0.3软件分析得到最佳的提取工艺条件：乙醇浓度61%、料液比1∶32、提取时间51 min、提取温度49 ℃，迷迭香脂溶性抗氧化剂得率预测值可达5.418%，进行3次平行试验验证，得到平均得率实际值为5.401%，与预测值接近，表明该模型具有较好的预测性能；迷迭香水溶性抗氧化剂的最佳提取条件：乙醇浓度42%、料液比1∶30、提取时间52 min、提取温度60 ℃，此时的迷迭香水溶性抗氧化剂得率预测值为0.764%，在最佳的提取条件下，进行3次平行试验验证，迷迭香水溶性抗氧化剂得率平均为0.755%，与预测值接近，表明该模型具有一定的可靠性。

2.3 迷迭香抗氧化剂体外抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH清除能力

由图2可知，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂对DPPH具有一定的清除能力。随着质量浓度的增加，清除能力呈上升趋势，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂在较低浓度时对DPPH自由基的清除能力低于Vc，但当质量浓度大于0.08 mg/mL时，其抑制效果逐渐接近Vc。迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂和Vc清除自由基的IC50分别为0.0293，0.0454，0.0101 mg/mL，可看出迷迭香脂溶性抗氧化剂的清除能力强于水溶性抗氧化剂，但稍弱于Vc。

图2 迷迭香抗氧化剂DPPH自由基清除效果Fig.2 Scavenging effect of antioxidants from Rosmarinus officinalis on DPPH radicals

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

图3 迷迭香抗氧化剂ABTS+自由基清除效果Fig.3 Scavenging effect of antioxidants from Rosmarinus officinalis on ABTS+ radicals

由图3可知，随着浓度的增加，其对ABTS+自由基的清除能力逐渐增强，在低浓度时，迷迭香水溶性的清除自由基能力低于脂溶性和Vc，当质量浓度为0.4 mg/mL时，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂和Vc对ABTS+自由基的清除率分别达到92.86%、86.4%和96.7%。它们三者的IC50分别为0.0617，0.1334，0.04035 mg/mL。说明迷迭香脂溶性抗氧化剂对ABTS+自由基的清除能力强于水溶性抗氧化剂，但稍弱于Vc。

2.3.3 铁还原力

图4 迷迭香抗氧化剂铁还原力Fig.4 Iron reducing power of antioxidants from Rosmarinus officinalis

吸光度值可表示其还原能力的强弱[21]。由图4可知，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂和Vc的吸光度值均随着样品质量浓度的增加而上升，说明迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂均具有一定的还原能力。其中迷迭香脂溶性抗氧化剂的还原能力较强于水溶性抗氧化剂，但二者与Vc相比还原力较弱。

3 结论

本研究对迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂的提取工艺进行优化，并对其抗氧化活性进行研究。通过响应面优化试验，建立乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四因素三水平的回归模型拟合方程，最终确定迷迭香脂溶性抗氧化剂的最优条件为乙醇浓度61%、料液比1∶32、提取时间51 min、提取温度49 ℃，得率为5.401%；水溶性抗氧化剂的最优条件为乙醇浓度42%、料液比1∶30、提取时间52 min、提取温度60 ℃，得率为0.755%。

此外，相同质量浓度条件下，迷迭香脂溶性、水溶性抗氧化剂与Vc溶液对DPPH自由基的清除能力均强于ABTS+自由基清除能力。综合比较3种体外抗氧化活性评价指标，迷迭香脂溶性、水溶性提取物均表现出较强的抗氧化能力。