加热温度对罗汉果香料制备的影响研究

许春平，王宣静，高明奇，张弛，杨雯静，邢雨晴，朱丽，黄家乐，郝辉*

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450001; 2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州 450016)

罗汉果，又名长寿果，广泛分布于广西、江西、湖南、广东、贵州等地，是我国特有的经济、药用植物，被列为“药食同源”品种，果实中含有丰富的葡萄糖、蛋白质、脂类等[1]，具有止咳祛痰、抑菌、抗氧化等药理作用, 被广泛开发为食品、保健食品和药品。

美拉德反应发生在羰基化合物和氨基化合物间，是目前较为流行的一种香料生产应用技术，在食品、医药和香料等领域广泛应用[2-3]。糖类在高温条件下熔融经过一系列反应变为黑褐色物质的过程，称为焦糖化作用[4-5]。在酸、碱条件下均可进行，糖在强热的情况下生成两类物质:一类是糖的脱水产物，即焦糖或酱色；另一类是裂解产物，即一些挥发性的醛、酮类物质，它们进一步缩合、聚合，最终形成深色物质。

目前，关于罗汉果的研究多集中于其生物活性成分方面[6-7]，本研究通过将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液进行掺配后进行不同温度的加热反应制备罗汉果香料，通过GC-MS分析及主成分分析对其挥发性成分进行探索，结合嗅香评价判断最优的反应条件，为罗汉果的应用提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗汉果：购自广西壮族自治区桂林市。

试剂：氢氧化钠、二氯甲烷(AR，沧州天工化工产品有限责任公司)；乙酸苯乙酯(色谱纯，苏州鼎亚化工有限公司)；食用葡萄糖(内蒙古阜丰生物科技有限公司)；无水碳酸钠、无水硫酸钠(分析纯，天津大茂化学试剂厂)。

仪器：1000C不锈钢粉碎机 永康市红太阳机电有限公司；TGL-16M离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；集热式磁力搅拌器、DF-101S油浴锅 上海予申仪器有限公司；同时蒸馏萃取装置 郑州长城科工贸有限公司；Agilent GC6890-MS5973N 型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗汉果提取物的制备

将罗汉果粉碎后过20目筛，准确称取200 g罗汉果粉，加入4000 mL水，在60 ℃下搅拌6 h后离心，在滤渣中加入2000 mL水继续在60 ℃下搅拌2 h后离心，合并滤液，将滤液旋转蒸发，得到罗汉果提取物52.54 g。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制备

根据预实验，准确称取100 g无水葡萄糖，加入糖质量20%的无水碳酸钠作为反应助剂，加入250 mL水，超声搅拌均匀后在160 ℃的油浴锅中加热30 min，制备焦糖化料液。

1.2.3 掺配料进行加热反应

将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例进行掺配，用1 mol/L的NaOH溶液调pH为7，将掺配料分为5份并标号A、B、C、D、E，在油浴锅中进行加热反应，时间设置为1 h，对应温度分别设置为80，100，120，140，160 ℃。

1.2.4 萃取香味物质

加热反应结束后，各取1 mL反应物加入30 mL二氯甲烷，超声萃取1 h，在50 mL分液漏斗中静置30 min，分液后在二氯甲烷萃取液中加入10 g无水硫酸钠，然后在35 ℃的水浴锅中进行浓缩，浓缩后用注射器过孔径为0.22 μm的有机滤膜转移至气质样品瓶中，加入50 μL浓度为0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(内标物)，以备GC-MS分析。以内标法对物质进行定量分析。挥发性物质含量(μg/mL)=[内标物质量(μg)×挥发性物质峰面积]/[内标物峰面积×样品体积(mL)][8]。

1.2.5 GC-MS条件

GC条件：色谱柱：HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm)；载气(He)流速3 mL/min；进样量 1 μL；升温程序： 50 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；进样口温度：280 ℃；分流比：10∶1。

MS条件：EI离子源；离子源温度270 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃；采集模式：Scan；扫描范围：35～550 m/z。

1.2.6 主成分分析方法

采用软件IBM SPSS Statistics 22.0进行检验，采用PCA统计建立样品与各挥发性组分之间的关系。

1.2.7 嗅香评价

准确称取1 g罗汉果提取物，用5 mL去离子水溶解，溶解后置于密闭的磨口瓶中，由6名受过专业训练的感官评定员组成的感官评定小组进行嗅香评价，嗅其挥发性香气，分辨其香气特色，评定其类型、风格[9]。

2 结果与分析

2.1 不同加热温度样品挥发性成分的GC-MS 结果分析

5个样品的挥发性成分经GC-MS 检测结果见表1。

表1 不同加热温度样品挥发性成分含量Table 1 Content of volatile components in samples heated at different temperatures μg/mL

续 表

续 表

由表1可知，5个样品已鉴定出的挥发性成分主要包括醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、烷烃类、烯烃类、酯类、胺类等，A、B、C、D、E样品的挥发性物质种类分别有25，33，24，20，21种，其中样品B(反应温度为100 ℃)鉴定出的挥发性成分种类最多；对应的挥发性成分总量依次为437.42，593.45，653.93，733.41，684.36 μg/mL。其中样品D(反应温度为140 ℃)鉴定出的挥发性成分含量最多。

其中醛类、酮类、酯类在总含量中占比较大，醛类物质的总含量随着反应温度的升高逐渐升高，5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural,5-HMF)是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下水解产生的一种呋喃类化合物，是焦糖化反应和美拉德反应的典型产物之一[10-12]。章银良等[13]认为美拉德反应是5-HMF形成的重要途经，并对酪蛋白-木糖模拟体系进行研究发现， 5-HMF的生成量随着反应温度和时间的增加相应增加，同时其产物对DPPH自由基的清除率也相应增大。杨楠等[14]将油茶籽进行红外加热处理后发现，随着反应时间的延长，油茶籽内5-HMF等美拉德反应产物的生成量逐渐增多。相同反应时间内，5-HMF形成量随着反应温度的升高而增加。近年来5-HMF的生物活性受到人们的广泛关注，有研究发现5-HMF具有抗氧化、改善学习记忆、抗过敏、保护神经细胞等对人体有益的作用[15-16]。

酮类物质、酯类物质的总含量随着反应温度的升高先上升后下降，在140 ℃时达到最高。2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮是一种白色结晶物质, 低温下比较稳定，加热后所得到的混合物具有焦甜和融熔黄油的香味[17]。吡喃酮、呋喃酮、烯醇酮等物质多为美拉德反应的特征产物，一般风味阈值较低，对产物香味有较好影响。 酯类物质自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香气味，还能够调和其他物质的刺激感和苦味。己二酸二异辛酯略有气味，属于增塑剂，虽然在样品中含量占比较大，但对整体气味的贡献较低。

2.2 主成分分析

利用主成分分析对不同加热温度罗汉果样品中59种挥发性成分进行分析[18]，得到4种主成分特征值和贡献率(见表2)、载荷矩阵表(见表3)。

表2 4种主成分的特征值和贡献率Table 2 Characteristic values and contribution rates of four principle components

由表2可知，第1主成分的贡献率为45.451%, 第2主成分的贡献率为31.535%, 第3主成分的贡献率为13.534%，主成分1，2，3的累计贡献率达到90.520%，基本代表了样品主要挥发性成分的组成, 反映了原始变量的绝大部分信息, 达到了降维目的。说明罗汉果中59种挥发性成分，可以用主成分1，2，3进行主成分分析。

表3 主成分载荷矩阵

续 表

由主成分载荷矩阵表(见表3)可以得出在主成分1中，载荷值较高的正影响挥发性成分有2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、二十三烷、角鲨烯、17-戊三酮等，载荷值依次是0.982，0.979，0.974，0.969，主要指向酚类、烃类、酮类物质；负影响最大的为六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，载荷值为-0.872。在主成分2中，载荷值较高的正影响挥发性成分有六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、1-十九碳烯、正二十烷、17-戊三酮等物质，载荷值依次是0.427，0.351，0.282，0.233，主要指向酮类、烃类物质；负影响最大的为己二酸二(2-乙基己)酯，载荷值为-0.971。在主成分3中，载荷值较高的正影响挥发性成分有1-[对溴苯基]-4-硝基-1,3-丁二烯、17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、2,4′-二羟基-3′-甲氧基苯乙酮、8-羟基-2,5-二甲基氢氧化物内盐噻唑[3,2-a]吡啶、O2-丁基O1-(2-甲基丙基)苯-1,2-二羧酸酯等物质，载荷值依次是0.288，0.288，0.288，0.288，0.288，主要指向烃类、醇类、酮类、杂环类等物质；负影响最大的为3,5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮，载荷值为-0.839。主成分载荷矩阵显示了各变量与各主成分之间的关系，数值的绝对值越大，表明该指标与某一主成分的联系紧密程度越大，反映了该指标在该主成分上的载荷程度；载荷值小的挥发性成分对罗汉果的挥发性风味贡献小，同时也表明其含量极低或未检出[19]。

计算上述多元变量和方差递减排列得出5个样品中的第1、第2、第3主成分值，然后以得分为坐标生成旋转空间分散图见图1、旋转空间成分图见图2。

图1 不同温度处理的5个样品的旋转空间分散图Fig.1 Rotational spatial dispersion diagram of five samples treated at different temperatures

图2 不同温度处理的5个样品的旋转空间成分图Fig.2 Rotational spatial composition diagram of five samples treated at different temperatures

由图1可知，5个样品根据距离远近可分为3个区域，3个区域内样品彼此间差异较大，A样品与E样品各自分为一个区域，B、C、D样品彼此距离较近分为一个区域，表明B、C、D样品的主成分差异较小。

由图2可知，对A样品特征香气影响较大的香味物质主要包括17-甲基-5-α-雄甾-2-烯-17-β-醇、正十八烷、正二十四烷等；对B样品特征香气影响较大的香味物质主要包括1-二十二烯、1-十九碳烯、棕榈酸甲酯等；对C样品特征香气影响较大的香味物质主要包括糠醛、3,5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、3-甲基二十烷等；对D样品特征香气影响较大的香味物质主要包括2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羟甲基二氢呋喃-2-酮、香草醛等；对E样品特征香气影响较大的香味物质主要包括2-乙酰基吡咯、糠醇、5-羟甲基糠醛等。

2.3 嗅香评价

综合各评价员的嗅香结果，见表4。

表4 5个罗汉果样品嗅香评价表Table 4 Olfactory evaluation table of five M. grosvenori samples

GC-MS分析发现D样品中挥发性物质的含量最多，主成分分析发现D样品挥发性物质分布较为密集，且多为醛、酮类物质。酮类物质具有一定的果香味，有研究表明一些酮类物质在低阈值时与醛类或其他物质存在相互作用，产生气味增强或改变的现象[20]。通过嗅香进一步分析5个罗汉果样品在感官品质上的差异性，结合表4可知，5个样品嗅香各不相同，其中D样品醇厚感较强，嗅觉层次较丰富，甜香、果香、膏香、药草香明显，感官品质最好。

3 结论

本实验通过将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液掺配后进行不同温度的加热反应制备罗汉果香料，通过GC-MS分析发现D样品(反应温度为140 ℃)中挥发性物质的含量最多，B样品(反应温度为100 ℃)中挥发性物质的种类数最多。主成分分析发现主成分1、主成分2、主成分3的累计贡献率达到90.520%，基本代表了样品主要挥发性成分的组成,反映了原始变量的绝大部分信息,达到了降维目的。5个样品根据距离远近可分为3个区域，3个区域内样品彼此间差异较大，A样品与E样品各自分为一个区域，B样品、C样品、D样品彼此距离较近分为一个区域，表明B、C、D样品的主成分差异较小。D样品挥发性物质分布较为密集，对其特征香气影响较大的香味物质主要包括2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羟甲基二氢呋喃-2-酮、香草醛等，嗅香分析发现D样品(反应温度为140 ℃)中醇厚感较强，嗅觉层次较丰富，甜香、果香、膏香、药草香明显，感官品质最好。结合上述结果可认为反应温度为140 ℃时得到的样品具有最佳的风味和感官品质。