产几丁质脱乙酰酶Lysinibacillus macroides ZCGT05的筛选及酶学性质研究

苗德升，丁志雯，李甜，李泽信，陈佳雨，钱亮亮，房耀维，刘姝*

(1.江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.连云港市质量技术 综合检验检测中心，江苏 连云港 222006)

几丁质是一种含氮的多糖物，又称甲壳质、甲壳素等，是自然界中含量非常丰富的生物聚合物[1]。几丁质难溶于一般的酸碱，化学性质非常稳定，这是制约其开发应用的重要原因[2]。壳聚糖是几丁质脱除乙酰基后的多糖化合物，经脱乙酰基后的壳聚糖虽然不溶于水、碱溶液和有机溶剂，但可溶于稀酸溶液，在医药、化工等领域有广泛的研究和应用[3-4]。

目前，化学法是工业化生产壳聚糖的主要方法，该方法以几丁质为原料，通过浓碱处理，得到的产品脱乙酰度不均一，且反应过程中易生成有毒物质，会造成严重的环境污染[5]。生物法利用几丁质脱乙酰酶催化几丁质脱乙酰基，对几丁质分子的主链不发生降解，可以制备出脱乙酰度均一的壳聚糖[6]。虽然生物法利用几丁质脱乙酰酶催化几丁质具有安全环保、产品性质较稳定等优点[7]，但存在几丁质脱乙酰酶活力较低、催化温度较高等问题[8]。因此，本研究筛选低温产几丁质脱乙酰酶菌株，为开发生物酶法工业制备壳聚糖所用的几丁质脱乙酰酶制剂奠定了试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

海底泥样：采集于高公岛海域。

1.2 培养基

富集培养基：壳聚糖2.5 g/L，磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钠0.1 g/L，蒸馏水配制，pH 7.0。

筛选培养基：几丁质2 g/L，磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，对硝基乙酰苯胺0.2 g/L，琼脂20 g/L，陈海水配制，pH 7.0。

发酵培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO40.5 g/L，陈海水配制，pH 7.0。

1.3 仪器设备

SW-CJ-1D 超净工作台 苏州净化设备有限公司；JXN-26 高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；分光光度计 杭州明基科学仪器有限公司；PCR仪 德国Eppendorf有限公司；Nikon 90i全电动显微镜 上海普赫光电科技有限公司；SPX-250B-2 生化培养箱 上海博迅实业有限公司。

1.4 低温产几丁质脱乙酰酶菌株的筛选

初筛：称取5 g泥样置于50 mL富集培养基中，于25 ℃，180 r/min条件下培养3 d。吸取富集样液用灭菌陈海水稀释10倍。将稀释液涂布于筛选培养基中，于25 ℃条件下培养3～5 d。

复筛：将初筛得到的菌株转接到种子培养液中，再以3%的接种量接种至发酵培养基，在25 ℃，180 r/min条件下培养3 d后将发酵液离心，测定发酵上清液中几丁质脱乙酰酶的酶活。

1.5 几丁质脱乙酰酶酶活力的测定

对硝基乙酰苯胺标准曲线的绘制：精准称取0.01 g对硝基乙酰苯胺倒入烧杯中，加入少量蒸馏水，用磁力搅拌器加热搅拌，使之溶解，冷却后定容到100 mL容量瓶中，混匀。取6支具塞比色管，用蒸馏水进行梯度稀释，最终对硝基乙酰苯胺溶液的浓度分别为0，2，4，6，8，10 mg/L。以蒸馏水作参比，测定各管在400 nm处的吸光值(A400)。以对硝基乙酰苯胺浓度为横坐标、400 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线[9]。

酶活的测定：在离心管中加入25 ℃、pH 7.0的磷酸缓冲液，对硝基乙酰苯胺溶液1 mL，酶液1 mL，25 ℃水浴孵育15 min，沸水浴终止酶促反应，离心后测定上清液的吸光度。以添加1 mL同样浓度沸水浴灭活15 min的酶液作为对照。

酶活单位(U)定义：将该反应体系中每1 h产生1 μg对硝基乙酰苯胺所需要的酶量定义为1个酶活力单位。

1.6 菌株ZCGT05的鉴定

根据伯杰氏细菌鉴定手册，对菌株进行形态学观察和生理生化鉴定。利用基因组提取试剂盒提取的菌株基因组DNA为模板，利用通用引物进行16S rDNA的扩增。扩增产物送至基因测序公司进行测序，所得的序列上传至GenBank，通过Blast程序与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，并用MEGA 11.0软件构建进化树。

1.7 L. macroides ZCGT05几丁质脱乙酰酶酶学性质研究

1.7.1 温度对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响

根据上述酶活测定方法，采用pH 7.0的磷酸缓冲液，在温度为10，15，20，25，30，35，40 ℃下进行酶活测定。将反应液在上述温度下保温0～10 h，每隔2 h进行1次酶活测定，以各个温度下0 h的酶活为100%，研究其温度稳定性。

1.7.2 pH对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响

根据上述酶活测定方法，将温度保持在25 ℃，在pH为5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9条件下进行酶活测定。将反应液在上述pH下保温0～10 h，每隔2 h进行1次酶活测定，以各个温度下0 h的酶活为100%，研究其pH稳定性。

1.7.3 金属离子对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响

根据上述酶活测定方法，在反应体系中加入相同离子浓度的金属盐KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，并进行酶活测定。

2 结果与分析

2.1 产几丁质脱乙酰酶菌株的筛选

取富集培养后的样品稀释液涂布于筛选培养基上，通过变色圈法筛选得到5株产黄色变色圈明显的菌株，变色圈最大的菌株为ZCGT05，见表1及图1。

表1 产几丁质脱乙酰酶菌株的筛选Table 1 Screening of chitin deacetylase-producing strains

图1 菌株ZCGT05在筛选平板上的变色圈Fig.1 The discoloration circle of ZCGT05 strain on the screening plate

菌株转接入种子培养液中培养，再以3%的接种量接种至发酵培养基，在25 ℃，180 r/min的条件下培养72 h后将发酵液于8000 r/min离心10 min，测定发酵上清液中几丁质脱乙酰酶的酶活。菌株ZCGT05酶活最高，达到10.18 U/mL。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株ZCGT05的形态学特征

由图1可知，菌株ZCGT05在2216E培养基上25 ℃培养3 d，菌落呈圆形，淡黄色，半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径在0.5～0.8 cm，易挑取。

2.2.2 菌株ZCGT05的生理生化特征

菌株ZCGT05的生理生化试验结果见表2。

表2 菌株ZCGT05的生理生化试验结果Table 2 Physiological and biochemical test results of ZCGT05 strain

由表2可知，明胶液化试验、H2O2试验、柠檬酸盐试验均呈阳性，吲哚试验、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、果糖、反硝化试验均为阴性。根据形态学特征，结合生理生化结果，初步将菌株ZCGT05鉴定为Lysinibacillusmacroides。

2.2.3 菌株ZCGT05的16S rDNA扩增及分析

将PCR产物送至南京思普金公司测序，所得序列提交GenBank(登录号：MK263030)。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现与菌株Lysinibacillusmacroides(登录号：NR114920.1)16S rDNA相似性最高，达到99%。用MEGA 11.0软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树，菌株ZCGT05与Lysinibacillusmacroides亲缘关系最近，见图2。目前，尚未见延长赖氨酸芽孢杆菌产几丁质脱乙酰酶的报道。

图2 基于16S rDNA序列菌株L. macroides ZCGT05的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of L. macroides ZCGT05 based on 16S rDNA sequence

2.3 L. macroides ZCGT05几丁质脱乙酰酶酶学性质研究

2.3.1 温度对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响

以对硝基乙酰苯胺浓度为横坐标、400 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线(见图3)。线性方程为：y=0.0586x+0.0038，R2为0.9992，吻合度较高。

图3 对硝基乙酰苯胺标准曲线Fig.3 The standard curve of p-nitroacetanilide

图4 温度对L. macroides ZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由图4可知，随着温度的升高，相对酶活先上升后下降，当温度为25 ℃时酶活最高，故该酶的最适温度为25 ℃。目前，几丁质脱乙酰酶的最适催化温度为30～60 ℃，多数催化温度为50～60 ℃，低温几丁质脱乙酰酶鲜有报道。秦汪艳等[10]报道了菌株Peniciliumjanthinellum几丁质脱乙酰酶的最适温度为30 ℃；菌株ColletotrichumgloeosporioidesCF-6几丁质脱乙酰酶的最适温度为28 ℃[11]。菌株L.macroidesZCGT05产几丁质脱乙酰酶的最适温度为25 ℃，在工业应用中可节省用于加热提高反应温度的能耗。

2.3.2 温度对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶稳定性的影响

图5 温度对L. macroides ZCGT05几丁质 脱乙酰酶稳定性的影响Fig.5 Effect of temperature on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

通过测定菌株L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶在不同温度(15～30 ℃)下水浴不同时间后的相对酶活来研究酶的热稳定性。由图5可知，25 ℃水浴10 h后相对酶活仍达到80%，30 ℃水浴10 h后相对酶活仅为26%。

2.3.3 pH对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响

图6 pH对L. macroides ZCGT05几丁质 脱乙酰酶活性的影响Fig.6 Effect of pH on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由图6可知，随着pH增大，相对酶活先上升后下降，当 pH为7.0时酶活最高，该酶的最适pH为7.0。目前报道的几丁质脱乙酰酶的最适pH为3.5～12.0，多数为偏酸性。只有菌株Aspergillusflavus和菌株Micromonosporaaurantiaca几丁质脱乙酰酶最适pH为7.0[12-13]。

2.3.4 pH对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶稳定性的影响

图7 pH对L. macroides ZCGT05几丁质 脱乙酰酶稳定性的影响Fig.7 Effect of pH on the stability of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

将菌株L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶在不同pH(6.5～8.5)下孵育不同时间后测定其相对酶活，结果表明，孵育时间越长相对酶活越低。由图7可知，不同pH条件下的相对酶活在孵育2 h内均能达到80%以上，但孵育10 h后，pH为6.5和8.5条件下的相对酶活较低，pH 7.5条件下的相对酶活在孵育10 h后仍可达到81%。

2.3.5 金属离子对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响

金属离子对L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶活性的影响见图8。

图8 金属离子对L. macroides ZCGT05几丁质 脱乙酰酶活性的影响Fig.8 Effect of metal ions on the activity of L. macroides ZCGT05 chitin deacetylase

由图8可知，Co2+、Mg2+、Mn2+对酶活有促进作用，Zn2+、Ca2+对酶活的促进作用相对较低，而K+、Fe2+、Cu2+对酶活具有抑制作用。不同来源的几丁质脱乙酰酶受金属离子对其酶活的影响各有不同，如Mn2+对Bacillusamyloliquefaciens Z7几丁质脱乙酰酶有强烈抑制作用， Fe2+对Bacillusamyloliquefaciens Z7的酶活具有一定促进作用[14-15]。

3 结论

本研究从连云港市海州湾海域海泥样品中筛选获得了一株产几丁质脱乙酰酶细菌菌株ZCGT05，通过菌落形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析将该菌株鉴定为Lysinibacillusmacroides。L.macroidesZCGT05几丁质脱乙酰酶最适温度和pH分别为25 ℃和7.0，在20～25 ℃保温2 h，残留酶活高于85%；在pH 7.0～8.0孵育2 h，残留酶活高于90%。Co2+、Mg2+、Mn2+对酶活有显著激活作用，而Cu2+对酶活有显著抑制作用。