DWI联合血清miR-375水平评估宫颈癌患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的价值

王 昆，吴晓琼，郑小令，沈长青

儋州市人民医院放射科，海南 儋州 571700

腹腔镜全子宫切除术作为早期宫颈癌（cervical cancer，CC）首选治疗方式，可解除肿瘤占位性效应，延长患者生存期，但部分患者术后可能会出现远期淋巴结转移，导致预后不良［1］。目前，穿刺活检是肿瘤淋巴结转移诊断“金标准”，该检查方式虽可明确观察病灶变化情况，但无法定量分析肿瘤淋巴结转移风险，且穿刺活检作为有创性检查，部分患者接受度低［2］。随着影像学技术的发展，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因具有图像对比度高、无辐射等优势得到广泛应用，其中弥散加权成像（diffusion-weighted imaging，DWI）序列能够提高常规MRI评估肿瘤浸润深度与淋巴结转移准确度［3］。有研究［4］发现，微小RNA（microRNA，miRNA）异常表达与CC的发生、发展密切相关，其中miR-375作为非编码RNA，可参与肿瘤细胞分化、凋亡过程，且与转录因子SPI结合而抑制肿瘤细胞侵袭、转移。基于miR-375的作用机制，我们推测miR-375水平可能与CC患者淋巴结转移有关，且联合DWI评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移应有一定价值，有鉴于此，本研究重在分析DWI联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险的价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2016年1月—2018年4月于儋州市人民医院接受腹腔镜全子宫切除术治疗且术后3年内发生远期淋巴结转移的47例CC患者资料，纳入淋巴结转移组；另收集同期接受腹腔镜全子宫切除术治疗且术后3年内未发生远期淋巴结转移的47例CC患者资料，纳入无淋巴结转移组。所有患者临床、影像学检查及实验室检查资料等均完整。纳入标准：① CC符合《现代肿瘤学》［5］中相关标准，且经手术后病理学检查确诊；② 首次接受腹腔镜全子宫切除术治疗；国际妇产科联盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO）［6］分期为Ⅰb-Ⅱa期；③ 凝血功能及免疫系统正常；④ 有随访资料；⑤ 图像质量清晰、符合研究标准。排除标准：① 合并乳腺癌、胃癌等其他恶性肿瘤；② 合并先天性心脏病、肝肾功能衰竭等重要脏器病变；③ 术前接受放化疗等相关治疗；④ 合并子宫肌瘤、子宫腺肌症等其他子宫疾病；⑤ 手术后病理学检查证实术前淋巴结转移；⑥ 随访期间出现骨转移、肺转移等。

1.2 方法

1.2.1 淋巴结转移评估

统计CC患者术后3年内淋巴结转移发生情况，淋巴结转移参照计算机体层成像（computed tomography，CT）诊断相关标准［7］（CT检查可见结节最短径≥10 mm，结节边缘可见分叶毛刺或边缘清晰，呈边缘强化，中央坏死呈囊状改变），或依据穿刺活检结果进行判断；本研究中单独CT检查检出20例，穿刺活检检出27例。

1.2.2 DWI检查

术前采用德国Siemens公司的MAGNETOM Spectra 3.0 T MRI扫描仪对患者进行检查，线圈选用8通道体相控阵线圈。嘱咐患者检查前8 h禁食（对于有节育环的患者需先将其取出），检查前30 min饮水保持膀胱充盈；患者取仰卧位，对其盆腔进行MRI常规T1加权成像（T1-weighted imaging，T1WI）、T2加权成像（T2-weighted imaging，T1WI）扫描及DWI扫描。横轴面T1WI扫描参数：重复时间（repetition time，TR）为536 ms，回波时间（echo time，TE）为20 ms，层间隔为1 mm，层数为30层，层厚为4.5 mm，矩阵为384×269，视野为420 mm×420 mm，激励次数为1；矢状面T2WI扫描参数：TR为6 630 ms，TE为77 ms，间距为1 mm，层数为30层，层厚为4 mm，矩阵为320×224，视野为350 mm×350 mm，激励次数为2；冠状面T2WI扫描参数：TR为4 000 ms，TE为50 ms，间距为1 mm，层数为30层，层厚为4 mm，矩阵为320×182，视野为340 mm×341 mm，激励次数为1；DWI扫描参数：TR为4 600 ms，TE为57ms，间距为1 mm，层数为121层，层厚为4.5 mm，矩阵为160×95，视野为258 mm×420 mm，激励次数为1、6，b值取0 s/mm2、800 s/mm2。采用Siemens Workstation工作站处理图像，勾画图像病变中心感兴趣区，注意勾画时需避开病灶坏死、出血部位，测定图像表观弥散系数（apparent diffusion coefficient，ADC），连续测定3次，最终结果取3次平均值。

1.2.3 血清miR-375及相关实验室指标检测

血清miR-375检测：术前采集患者空腹肘静脉血5 mL，置于促凝管内，在4 ℃环境下用低速离心机（山东博科生物产业有限公司，型号为TD-5E）以1 500 r/min转速离心10 min，离心半径为10 cm，然后采用高速离心机（山东博科生物产业有限公司，型号为Micro17R）以13 800 r/min转速离心15 min，离心半径为10 cm，采集血清，于-80 ℃冰箱内贮存、待检；取200 μL血清标本，用miRCURY试剂盒提取标本总RNA，然后进行反转录反应，反应体系共20 μL，包括miRNA RT酶混合物 2 μL、0.1%牛血清白蛋白2 μL、去RNA酶水6 μL、2倍miRNA反应缓冲液混合物10 μL，依次在37 ℃环境下逆转60 min，在85 ℃环境下逆转5 s，用反转录试剂盒提取样本cDNA；取样本采用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分析仪（山东博科科学仪器有限公司，型号为Lepgen-96）测定miR-375水平，PCR扩增反应条件：95 ℃环境下反应30 s，60 ℃环境下反应5 s，64 ℃环境下反应34 s，设定45个循环，用2-△△CT法分析miR-375水平。

术前采集患者空腹肘静脉血5 mL，置于肝素抗凝管内，用低速离心机以4 000 r/min转速离心10 min，离心半径为10 cm，用化学发光法测定癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）125水平，检测试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司，检验流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 相关基线资料采集

设计基线资料填写表，阅读并记录患者相关基线资料，内容包括年龄、体重指数（body mass index，BMI）、FIGO分期（Ⅰ期、Ⅱa期）、肿瘤直径（影像学检查）、病理学类型（鳞癌、腺癌、腺鳞癌）、基底浸润深度（≥1/2、＜1/2）等。

1.2 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行数据处理。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；等级资料采用秩和检验；全部计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；偏态分布的计量资料采用中位数及四分位数间距M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；经logistic回归分析，探讨各主要变量与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的关系；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算曲线下面积（area under curve，AUC），以判定DWI联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险价值，AUC＞0.9表示评估性能较高，AUC为0.71～0.90表示有一定评估性能，AUC为0.50～0.70表示评估性能较差；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组DWI参数比较

淋巴结转移组ADC为0.99（0.84，1.11）×10-3mm2/s，无淋巴结转移组ADC值为1.34（1.12，1.64）×10-3mm2/s，组间ADC值比较差异有统计学意义（U=5.658，P＜0.001）。

2.2 两组基线资料、血清miR-375水平比较

淋巴结转移组血清CEA、CA125水平高于无淋巴结转移组，miR-375水平低于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间其他基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 两组基线资料、血清miR-375水平比较 n（%）

2.3 各主要变量与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的关系分析

纳入差异有统计学意义的变量（CEA、CA125、miR-375）作为自变量（均为连续变量），将CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移情况作为因变量（1=淋巴结转移，0=无淋巴结转移），经logistic回归分析结果显示，miR-375水平升高可能是CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移保护因子（OR＜1，P＜0.05，表2）。

表2 各主要变量与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的关系分析结果

2.4 DWI联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险的价值分析

将ADC值、miR-375作为检验变量，将CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移情况作为状态变量，绘制ROC曲线（图1）发现，ADC、miR-375单一及联合检测评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险的AUC分别为0.839、0.857、0.928，均有一定预测价值，当二者最佳诊断界值分别取1.065×10-3mm2/s、0.505时，预测价值最佳，且联合检测评估价值更高。相关参数见表3。

图1 ADC联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险价值的ROC曲线图

表3 DWI联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险价值分析结果

3 讨 论

随着宫颈细胞学筛查的应用，CC发病率及死亡率已显著降低，但近年来流行病学调查显示，CC发病呈年轻化趋势［8］。腹腔镜全子宫切除术是目前治疗CC最常用的外科术式，不仅可切除肿瘤病灶，还具有创伤小、并发症少等优势，利于患者康复，但部分患者术后可能会出现淋巴结转移，导致预后不良［9］。

MRI是诊断CC常用的影像学方式，可多参数、多方位观察肿瘤发生情况，其中DWI是最常用的功能成像技术，该技术利用组织内水分子弥散原理，通过观察正常组织与病灶中水分子弥散运动差异，判断病变情况［10］。据报道，正常组织细胞外间隙较大，利于水分子弥散运动，而肿瘤病灶多有细胞形态、细胞膜渗透性改变情况，细胞间隙相对较小，继而可能会限制水分子弥散［11］。ADC是DWI常用定量参数，该值主要反映水分子弥散强度，值越大即水分子弥散强度越大［12］。本研究结果显示，淋巴结转移组ADC值低于无淋巴结转移组，说明有淋巴结转移的CC患者ADC值较低，这与张晰等［13］研究结果一致。分析原因在于，伴有淋巴结转移的CC患者，肿瘤细胞侵袭、转移至淋巴结，会导致淋巴结内细胞间隙变小，从而限制水分子弥散，即ADC值低［14］。

CEA、CA125是临床评估CC常用的血清学指标，其中CEA是一种酸性蛋白，多存在于肿瘤细胞表面，其主要经细胞膜分泌至细胞外，水平升高提示机体可能存在肿瘤细胞［15］。CA125是由肿瘤上皮细胞分泌的糖蛋白，其水平升高不仅可提示肿瘤发生情况，还可促使肿瘤细胞逃避免疫系统，促进肿瘤细胞侵袭、转移［16］。本研究结果显示，淋巴结转移组血清CEA、CA125水平高于无淋巴结转移组，初步说明CEA、CA125可能与CC患者淋巴结转移有关，但回归分析结果显示CEA、CA125水平与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移无关，可能是因为受个体差异、非肿瘤慢性疾病等影响。因此，临床仍需寻求其他相关指标，以准确地评估CC患者淋巴结转移风险。

研究［17］发现，miRNA作为基因表达调控分子，在CC发展过程中具有重要作用。miR-375是miRNA家族的一员，参与细胞增殖、凋亡、分化过程，据报道miR-375可抑制YAP基因，增强细胞因子诱导杀伤细胞活性，杀伤肿瘤细胞，且可减弱SiHa细胞增殖能力，阻滞细胞周期在G1期，从而抑制肿瘤细胞侵袭［18］。同时，miR-375可结合SPI转录因子mRNA的3'UTR，影响SPI翻译，减少SPI表达，而SPI可介导多种下游基因促进肿瘤细胞侵袭、转移［19］。邓岳红等［20］研究显示，CC患者血清miR-375水平显著低于宫颈上皮内瘤变患者及健康人群，且miR-375对CC有一定诊断效能。基于miR-375的作用机制，推测其表达可能与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移有关。本研究初步比较淋巴结转移、无淋巴结转移CC患者血清miR-375水平及相关基线资料，回归分析结果显示，miR-375水平升高可能是CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的保护因子，证实了我们的猜测。分析可能原因在于，miR-375水平降低，会减弱对YAP基因、SPI转录因子翻译抑制作用，继而可能会使其利用多种机制促使肿瘤细胞转移，增加远期淋巴结转移风险［21］。

根据DWI诊断CC应用价值及miR-375与CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移的关系，推测二者联合检测评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险有一定应用价值。为验证假设，研究最后绘制ROC曲线发现，ADC、miR-375单独检测评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险均有较好的效果，但联合检测评估价值更高，在当二者最佳诊断界值分别取1.065×10-3mm2/s、0.505时，可获得最佳预测价值。基于此研究结果，对于腹腔镜全子宫切除术前DWI检查提示ADC低、血清miR-375水平降低的CC患者，术后可根据患者实际情况采取化疗、放疗辅助干预，以预防远期淋巴结转移，改善患者预后。

但本研究并未分析血清miR-375水平与CEA、CA125水平的相关性，且未评估CEA、CA125预测CC患者淋巴结转移风险的价值，同时每例患者连续检查3次，未评估患者间一致性，研究存在一定局限性，未来仍需展开前瞻性研究加以验证。

综上所述，DWI检查ADC值联合血清miR-375水平评估CC患者腹腔镜全子宫切除术后远期淋巴结转移风险有一定应用价值，考虑未来可进行术前DWI联合血清miR-375水平检查，辅助评估CC患者淋巴结转移风险。