皮革中富马酸二甲酯标准样品的研制与应用

黄志丁，肖巧喆，马琳

（1.国家市场监督管理总局认证认可技术研究中心，北京 100020；2.中国认证认可协会，北京 100020；3.中轻检验认证有限公司，北京 100015）

引言

皮革工业是轻工业的支柱产业之一，包括制革业、制鞋业、皮革服装业、皮具业、皮革制品业和毛皮业等主体行业以及与主体行业配套的皮革化工业、皮革机械制造业、皮革五金业和鞋材业等。随着现代制革工艺的日趋成熟，皮革工业发展迅速，2020 年我国规模以上轻革产量为5.77 亿平方米。我国的皮革业作为从传统工业升级的现代化产业，技术水平已取得了突飞猛进的发展，目前已发展成为皮革的生产大国、消费大国和出口大国。皮革制品在满足人们基本生活需求的同时，也在不断提升消费者的生活品质，传统的实用性、耐用性已不能满足现代消费者的需求，人们越来越关注皮革制品的安全卫生性能。

自2008 年10 月起欧盟方面陆续通报了多起因消费者接触含有富马酸二甲酯的鞋、皮沙发而产生皮肤过敏、急性湿疹及灼伤的案例。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMFu) 学名反丁烯二酸二甲酯，具有低毒高效、广谱抗菌、持久稳定等特点，20世纪80 年代后，作为防霉剂广泛应用于皮革、纺织及其制品的杀菌及防霉处理[1]。皮革中的胶原蛋白为霉菌生长提供营养源，因此在皮革生产加工过程中添加含有富马酸二甲酯的防霉剂能起到防霉防腐的作用。富马酸二甲酯与皮肤接触后易引起，容易引起接触性皮炎危害，出现持久过敏性发红瘙痒和灼痛症状[2]；富马酸二甲酯还可水解生成甲醇，对眼睛的刺激较大[3]。2009 年3 月17 日，欧盟成员国投票通过了保证含有富马酸二甲酯的消费品不会投放欧洲市场的欧盟委员会（European Commission）决议草案[4]。美国服装鞋类协会（AAFA）公布的全球限制物质名单（Restricted Substances List）第四版修正稿中包括富马酸二甲酯，涉及到的最终产品主要有家用纺织品、服装和鞋类。我国于2016 年1 月1日正式实施的强制性国家标准GB 30585-2014《儿童鞋安全技术规范》[5]明确要求儿童鞋类产品中DMFu 的质量分数不得超过0.1 mg/kg。

目前测定皮革和鞋类产品中富马酸二甲酯含量的主要方法有气质联用法[6]和高效色谱法[7]，现行有效的国家标准方法是GB/T 26702-2011《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》[8]和GB/T 26713-2011《鞋类化学试验方法富马酸二甲酯(DMF)的测定》[9]。然而，皮革基体复杂，样品中含有大量油脂、蛋白质、化学助剂和填料，其产生基体干扰效应对分析仪器影响非常严重，仅使用溶液标准样品采用外标法定量存在检测结果偏离的风险。实验室往往采用溶液标准样品加标的方式对实验室的检测活动进行监控，但这种方式对样品的前处理过程不能起到很好的监控效果。 此外，CNAS-CL01-A002:2018《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》中要求实验室使用与实际检测样品基体一致的质控样品实施质量控制，实验室迫切需要具有良好均匀性和稳定性的皮革基体质控样品。

研制皮革中富马酸二甲酯标准样品能够有效提高相关文字技术标准的可操作性，促进文字技术标准的贯彻和实施，提高皮革中富马酸二甲酯含量检测结果的准确性和可靠性，有助于建立皮革样品中富马酸二甲酯检测结果的溯源性。

1 技术路线

皮革中富马酸二甲酯标准样品的研制，主要参照GB/T 15000《标准样品工作导则》以及国内外现行的皮革样品前处理方法和富马酸二甲酯含量检测分析方法开展研究工作，技术路线如图1 所示。

图1 皮革中DMFu 标准样品的研制技术路线Fig.1 Technical route for production RM of DMFu in leather

2 皮革中富马酸二甲酯分析方法

本研究对皮革样品进行均匀性检验、稳定性检验和协作定值采用GB/T 26713-2011《鞋类化学试验方法富马酸二甲酯 (DMF) 的测定》或GB/T 26702-2011《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》，分析过程包括样品的萃取、浓缩、净化和测试。

2.1 萃取

准确称取0.2 g（精确至0.1 mg）样品，将样品置于具塞锥形瓶中立即加入10 mL 乙酸乙酯超声波萃取20 min，将萃取液经滤纸过滤到圆底烧瓶内，分别用10 mL 乙酸乙酯洗涤锥形瓶两次，将洗液与滤液合并。

2.2 浓缩

在55 ℃下用旋转蒸发仪将圆底烧瓶中的萃取液浓缩至1 mL。

2.3 净化

用5 mL 乙酸乙酯将中性氧化铝小柱（6 mL，1 g）润湿，用玻璃吸管将浓缩后的萃取液注入中性氧化铝小柱内，并用乙酸乙酯少量多次洗涤圆底烧瓶，洗液一次注入中性氧化铝小柱内，全部流出液收集到5 mL 容量瓶或带刻度离心管内，用乙酸乙酯定容至刻度。

2.4 测试

气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）参数：

a）色谱柱：HP-5，30 m×0.25 mm×0.25 μm

b）进样口温度：250 ℃

c）色谱-质谱接口温度：280 ℃

d）进样方式：不分流进样，1 μL

e）色谱柱温度：初始60 ℃，以5 ℃/min 升至100 ℃，再以25 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min

f）溶剂延迟时间：3 min

2.5 结果计算

按式（1）计算富马酸二甲酯含量：

式中：

X——试样中富马酸二甲酯的质量分数，单位为mg/kg；

cs——由标准工作曲线所得的试液中富马酸二甲酯的质量浓度，单位为mg/L；

c0——由标准工作曲线所得的空白试液中富马酸二甲酯的质量浓度，单位为mg/L；

V——试液的定容体积，单位为mL；

m——试样质量，单位为g。

3 标准样品的制备

为保证皮革中DMFu 标准样品与日常检测样品理化性能的一致，标准样品制备过程模拟制革工艺，并采用超微粉碎技术和筛分工序确保样品具有良好的均匀性。

3.1 原料的选择

供制革和毛皮工业加工的动物皮称为原料皮，制革工业中常用的原料皮包括猪皮、牛皮、羊皮等。本项目以市售绵羊皮（盐湿皮）为原料皮，经检测该原料皮中不含富马酸二甲酯，符合本项目对原材料的要求。

3.2 制备流程

制革工艺主要包括准备、鞣制、整饰三大工序（图2），总共涉及的步骤数十个。在目标物质最可能产生的步骤中添加适量的化学物质，可使制得的标准样品与实际样品保持最大程度的一致性。富马酸二甲酯有可能作为防霉剂应用于皮革及其制品的抗菌和防霉。因此，在皮革中富马酸二甲酯标准样品研制过程中，研制人员在涂饰步骤添加适量富马酸二甲酯。

图2 皮革中DMFu 标准样品的制备工艺Fig.2 Preparation process for RM of DMFu in leather

3.3 超微粉碎和筛分

为进一步保证皮革样品的均匀性，将制备好的样品切成小块（约为5 cm×5 cm）后，使用超微粉碎机对样品进行超微粉碎，粉碎前仪器经过细致清洗并晾干以防止粉碎过程中富马酸二甲酯的污染。为了防止超微粉碎机在运行过程中温度过高，采用低速、风冷、短时、多次粉碎的方法。即调节转速为500 r/min，同时开启旋风系统，先将块状皮革样品粉碎成粗颗粒（约15 min），待仪器停止并冷却后，将粗颗粒进一步粉碎成细颗粒。

将样品收集至26 目（孔径0.71 mm）标准筛中，底下套有80 目（孔径0.2 mm）标准筛，并牢牢固定于筛分仪中。在振荡频率为1460 r/min 条件下，筛分20 min，收集粒径为0.2～0.71 mm 的样品。粒径大于0.71 mm 的颗粒重新转移至粉碎室内，继续低速、短时、多次粉碎至所有皮革样品的粒径均小于0.71 mm。收集所有粒径为0.2～0.71 mm 的样品并转移至高速混合机中，高速搅拌30 min 后，收集样品于洁净、干燥的密封袋中。

从包装样品的密封袋中随机抽取10 个样品（取样量为0.2 g）进行均匀性初检。经检验，在重复性条件下测试10 次，测量平均值为228.7 mg/kg，相对标准偏差RSD 为2.6%，满足标准样品的要求。最后，为保证标准样品的长期稳定性，避免沾污和变质，在洁净的工作台上将样品装于带有密封内盖的棕色玻璃样品瓶中，并充氮气，每瓶装样品约2.0 g。再将样品瓶装入复合膜铝箔袋中并用真空封装机进行真空密封，分装后的样品置于阴凉干燥处保存。

4 均匀性检验

4.1 均匀性检验方法

样品的均匀性是标准样品最基本的属性，它用来描述标准样品特性量值的空间分布特征。本研究根据GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）》[10]要求，采用单因素方差分析法（F 检验）对皮革中富马酸二甲酯标准样品的均匀性进行检验。从本批次标准样品中随机抽取12 个单元样品，对其中的富马酸二甲酯含量进行均匀性检验。对抽取的每个单元样品，在重复条件下测试2 次，一共测试24 次。重复测试的样品分别单独取样，取样量为0.2 g。为了减小测量中定向变化的影响，样品所有重复测试按随机次序进行。均匀性检验采用GB/T 26702-2011 《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》。

4.2 均匀性检验结果

皮革中富马酸二甲酯标准样品的均匀性检验数据及统计计算结果见表1。

表1 皮革中DMFu 标准样品均匀性检验结果Tab.1 Result of homogeneity for RM of DMFu in leather

由以上检验结果可知，本批次皮革样品中富马酸二甲酯的统计计算F 值小于F0.05（11，12）的检验临界值，说明该标准样品在单元间和单元内不存在显著性差异，本标准样品的均匀性良好。

5 稳定性检验

5.1 稳定性检验方法

稳定性是标准样品的另一个重要技术指标，是用以描述标准样品特性量值随时间变化保持不变的能力，是确保标准样品能够有效使用的基本条件。本研究根据GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）》要求，采用一元线性拟合方程模型为稳定性研究基本模型，对皮革中富马酸二甲酯标准样品的稳定性进行评价。由于该标准样品的保存条件与实际运输环境条件近似，因此忽略运输等短期稳定性，主要考察样品在常温贮存条件下的长期稳定性。在样品制备完成后分别间隔2 个月、4 个月、6个月、12 个月、18 月、24 个月对样品的稳定性进行监测。每个时间点分别从库存样品中随机抽取2 个单元样品，每个单元样品平行测试3 次，以2 个单元样品的总平均值作为该时间点特性量值稳定性检验结果，稳定性检验测试方法采用GB/T 26702-2011《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》。

5.2 稳定性检验结果

将皮革中富马酸二甲酯稳定性检验结果与稳定性检验时间绘制成折线，观察各值随贮存时间的变化趋势。由图3 可知，本批次皮革中富马酸二甲酯含量在检验期内未见明显的变化趋势。

图3 皮革中DMFu 标准样品稳定性变化趋势图Fig.3 Stability trend for RM of DMFu in leather

皮革中富马酸二甲酯标准样品稳定性检验数据及统计计算结果见表2。

表2 标准样品稳定性检验结果Tab. 2 Result for stability of RM

由稳定性检验结果可知，本批次标准样品中富马酸二甲酯含量的统计结果数据满足关系式b1＜t(0.95,5)×s(b1)，说明该皮革样品中富马酸二甲酯的含量在24 个月的实验期间内无显著性差异，本标准样品在24 个月内是稳定的。

6 定值

定值是标准样品研复制的主要工作和关键内容，本研究依据国家标准GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》，采用多家实验室协作定值的方法，完成本次皮革中富马酸二甲酯标准样品的定值工作。

6.1 定值方案

为了确保协作定值数据准确可靠，本研究选择皮革中富马酸二甲酯检测项目获CNAS 认可的、技术能力较强的8 家皮革和鞋类检测机构，协作完成标准样品的定值工作。这些实验室分别采用国家标准GB/T 26713-2011《鞋类化学试验方法富马酸二甲酯(DMF)的测定》或GB/T 26702-2011《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》完成定值试验。

在本批次样品中随机抽取16 份样品用于协作定值研究，向每个实验室分别提供2 份，要求在2天内进行6 次重复测量。研制单位在发放样品时，同时发放了《协作定值作业指导书》和《协作定值报告单》，有效保证了8 家实验室测试结果的准确、可靠、可比。

6.2 协作定值数据统计分析

本次协作定值，首先剔除技术上的可疑数据，再通过统计检验方法剔除统计上的离群数据。统计过程中，首先处理组内数据，经格拉布斯（Grubbs）准则和狄克逊（Dixon）准则检验，对各实验室内的测试数据进行检验。两种方法都判为离群值的数据予以剔除，剔除的测试数据不再参加后续的统计处理。然后，采用科克伦（Cochran）检验法对各组数据进行等精度检验，本次定值各实验室均采用相同原理的测试标准方法，视为等精度，对科克伦（Cochran）检验中有显著性差异的数据组在进行审查后再决定是否剔除。剔除离群值后，先合并数据，将每个实验室测量数据的平均值视为单个数据，构成一组新的数据。 对新的数据采用夏皮罗- 威尔克（Shapiro-Wilk）法进行正态性考察，在服从正态分布或近似正态分布的条件下，再次采用Grubbs 准则进行检验，剔除离群值后将该组数据的算术平均值作为标准值。

6.3 协作定值结果

本次协作定值各实验室的定值结果数据列于表3。

表3 皮革中DMFu 标准样品协作定值数据汇总Tab. 3 Summary of collaborative certification for RM of DMFu in leather

经Grubbs 检验，所有实验室内测试数据的统计量Gn计算值在0.002～1.768 之间， 均小于Gn临界值1.887。经科克伦（Cochran）检验，8 组DMFu 测试数据等精度检验的统计量C 计算值为0.319，小于对应的临界值C(0.05，9，6)=0.360。将每个实验室的测试数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据，参照GB/T 4882-2001《数据的统计处理和解释—正态性检验》[11]进行正态性考察。DMFu 含量协作定值数据的统计量W 的计算值为0.955，大于对应的临界值W（0.95，8）=0.818。综上所述，本次协作定值8 家实验室的测试结果均为有效数据，全部用于标准值和不确定度的确定。

7 不确定度评定

标准样品的特性量值除了受测定影响之外，还受批量制备样品的瓶间均匀性、长期稳定性、短期稳定性的影响，这些因素对标准样品量值评定结果都有贡献。依据GB/T15000.3-2008 评定不确定度，数值修约按GB/T 8170-2008《数值修约规则与极限数值的表示和判定》[12]的规定进行。

标准样品特性值的合成不确定度可用式（2）表示：

式中：uc——特性量值的合成不确定度；

uchar——定值不确定度分量；

ubb——瓶间均匀性不确定度分量；

ults——长期稳定性不确定度分量；

usts——短期稳定性不确定度分量。

标准样品特性量值的不确定度主要由定值不确定度（uchar）、均匀性不确定度（ubb）、长期稳定性不确定度（ults）和样品运输等短期稳定性不确定度（usts）构成。由于该标准样品的保存条件与实际运输环境条件近似，同时根据稳定性检验的结果，该标准样品在常温保存条件下稳定性良好，因此忽略样品因运输等因素引入的不确定度，本项目主要考虑uchar、ubb和ults三个不确定度分量。由于本次标准样品的合作定值是由多个实验室，使用相同的标准方法协同进行定值，引起不确定度的来源多样且复杂，难于逐项进行不确定度的全面分析。参与定值的实验室均为通过资质认定及CNAS 认可的具有标准样品定值经验的实验室，具有较高的技术水平。因此可以认为测定的B 类不确定度基本上已经随机化，定值不确定度均归为A 类不确定度。

经评定，皮革中DMFu 标准样品的合成不确定度计算结果列于表4。

表4 皮革中DMFu 标准样品的合成不确定度Tab. 4 Combined uncertainty for RM of DMFu in leather

标准样品的结果表述为标准值和不确定度，综合以上协作定值以及不确定度的计算结果，皮革中DMFu 标准样品的标准值为协作定值结果的算术平均值，其扩展不确定度为：UCRM=k×uCRM，扩展因子k=2。因此，皮革中DMFu 标准样品的标准值和不确定度为：（227±20）mg/kg，k=2。

8 保存和使用

皮革中DMFu 标准样品是粉末状，每瓶净质量2.0 g，使用带有密封内盖的棕色玻璃样品瓶，样品瓶在铝箔纸袋中真空封装。建议在密封、避光、4℃以下条件保存，使用时先恒重至室温再取样。

使用时，建议称取0.2 g 标准样品，采用GB/T 26713-2011《鞋类化学试验方法富马酸二甲酯(DMF)的测定》或GB/T 26702-2011《皮革和毛皮化学试验富马酸二甲酯含量的测定》对皮革中DMFu标准样品进行测试。由于标准样品的不确定度UCRM 仅包含了与标准样品定值、均匀性、稳定性有关的不确定度，没有涉及用户在实验室里对标准样品进行测量有关的随机不确定度U测。因此，应采取公式（3）判断标准样品测量值与标准值之间是否存在显著性偏差：

式中，s代表标准偏差，n代表重复次数，t值可根据n和置信概率水平查表得到。若满足式（4），则表明测试结果未偏离，否则认为测试结果与标准值相比有显著性偏差。

9 结论

通过模拟实际的制革工艺，在涂饰步骤中添加一定量的富马酸二甲酯，制得皮革中富马酸二甲酯标准样品。采用超微粉碎和混匀技术确保标准样品的均匀性，同时采用真空避光密封包装的方式确保样品的稳定性。本批次皮革中富马酸二甲酯标准样品的标准值和不确定度为：（227±20）mg/kg，k=2。用户应妥善保存和正确使用标准样品，使用时应考虑实验室对标准样品进行测量有关的随机不确定度的影响。