肝爽颗粒联合恩替卡韦对乙型肝炎肝硬化患者血浆D-二聚体的影响

刘立 李俊义 刘春云 常丽仙 刘红明 黄红丽 罗煜 高建鹏

1昆明市第三人民医院（云南省传染性疾病临床医学中心）（昆明650041）；2 昆明医科大学附属第一医院老年科（昆明650000）

【关健词】 肝爽颗粒； 恩替卡韦； 乙型肝炎肝硬化； D-二聚体； 高凝状态； 门静脉血栓

乙型肝炎肝硬化（hepatitis B cirrhosis，HBC）是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）发展的较严重的阶段，HBC 的并发症较多，且抗病毒治疗的疗效仍不令人满意，预后极差，严重的甚至出现肝癌或死亡［1］。据调查，2009-2016年期间，由肝硬化造成的年病死率从10.5%升高到20.0%［2］。尽管随着我国乙肝疫苗接种的普及，新的CHB 的发病率大大下降，但我国CHB 的绝对人口数量仍然巨大，因此目前HBC 仍然极为常见。我国HBC 约占全部肝硬化病例的66.7%～75%［3］。HBC 患者存在不同程度的凝血功能障碍及纤维蛋白溶解系统异常。其中，D-二聚体（D-dimer，D-D）［4］是纤维蛋白单体经过活化因子的交联后，再经纤溶系统中的纤溶酶进行水解反应所产生的纤维蛋白特异性降解物，当体内D-D 的水平升高，表明体内继发性纤维的活性明显增强，因此D-D 是体内发生凝血障碍以及纤溶系统遭到破坏的标志物［5］。D-D 水平的升高也是非肿瘤性门静脉血栓形成（portal vein thrombosis，PVT）的危险因素［6］，特别是在病情比较严重的失代偿期肝硬化患者，D-D 水平的升高比较常见。而抗凝治疗尽管能降低PVT 的发生率［7］，但仅适用于肝储备功能相对好、凝血功能及血小板水平相对较好、既往未发生过出血的患者［8］，而失代偿期的患者抗凝治疗对此效果很差，且存在出血的风险。部分中药中的有效成分具有抗炎、抗氧化应激、调节免疫、抗纤维化、降低门静脉压力等作用，具有多途径、多靶点且不良反应少等优点。有研究表明［9］，肝爽颗粒（Ganshuang granule，GS）组方中的君药党参的主要提取物可以通过抑制VWF 信号级联的丝氨酸-苏氨酸激酶效应物Lyn 激酶，降低D-D浓度、血小板活化标记物CD41 浓度和血栓素A2 血清浓度，有效地防止缺氧诱导的血小板活化和由此产生的促凝状态，但尚缺乏临床的数据支持。基于此，本研究通过观察GS 联合恩替卡韦（Entecavir，ETV）对HBC 患者D-D 的影响，以期为临床提供必要的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月1日至2020年12月31日来昆明市第三人民医院就诊的门诊及住院的HBC 患者共371 例，其中男261 例，女110 例，年龄18 ～74 岁，平均年龄48.83 岁。纳入标准：（1）D-D 水平升高；（2）符合肝硬化的诊断标准［10］；（3）HBsAg 阳性超过半年、HBV DNA 阳性；（4）入组前半年内无抗病毒治疗史；（5）随访时间超过半年。排除标准：（1）合并可以引起血浆D-D 水平升高的其他疾病，如恶性肿瘤、心脑血管性疾病、原发性血液系统疾病等；（2）半年内使用抗凝或促凝药物；（3）合并其他嗜肝病毒感染、药物性、酒精性、中毒性、遗传代谢性、自身免疫性肝病等肝脏疾病；（4）肝癌；（5）妊娠及哺乳期妇女；（6）已诊断PVT 或其他部位栓塞者；（7）有脾脏切除术史、脾脏栓塞术史、分流术史或TIPS 术史等；（8）有恩替卡韦或肝爽颗粒使用禁忌症；（9）随访不足半年者或三个月内死亡者。本研究经昆明市第三人民医院伦理委员会审查批准（NO：昆三伦20170115）。所有患者均由本人或监护人签署知情同意书。

1.2 研究方法 观察组中男133 例，女58 例，年龄18 ～74 岁，平均48.29 岁；对照组中男118 例，女47例，年龄19 ～73岁，平均49.45岁。收集患者的基线指标，后每3个月检测一次。必要时增加相关检测。

每3 个月随访一次，以患者在本院的连续随访记录满12个月为随访终点。以基线、随访6个月、随访12 个月为主要观测时间点。计算患者在随访期间应用GS的累计日剂量（cumulate defined daily doses，cDDD）。服用GS≥180 cDDD的患者归为观察组。

1.3 治疗方法 所有患者均根据病情需要酌情给予安体舒通、呋塞米、白蛋白、血浆等常规对症支持治疗。在此基础上，按照随机分组的原则，将患者随机分为GS 联合ETV 分散片组（观察组）199 例和单用ETV 组（对照组）172 例。服用GS 和/或ETV时间超过半年。ETV 为0.5 mg/次，口服，1日1 次。GS 为3 g/次，1日3 次。最终资料完整者观察组191 例、对照组165 例。

GS 为保定天浩制药有限公司生产，3 克/袋，12袋/盒（生产批号：20180102）；ETV 为湖南千金协力药业有限公司生产，0.5 mg/片，14 片/盒（生产批号：20171230）。

1.4 检测仪器设备及试剂 血浆D-D 水平检测在治疗前、治疗后每3 个月检测一次，空腹抽取研究对象静脉血1.8 mL，109 mmol/L 枸橼酸钠0.2 mL 抗凝，3 000 r/min 离心，10 min 后分离血浆，取血浆在日本希森美公司生产的Sysmex CA-7000 全自动凝血分析仪上进行D-D 检测，采用免疫比浊法，试剂盒由Sysmex 公司提供。

临床生化检测使用日本奥林巴斯AU400 全自动生化仪（Japan，Olympus Optical Industry Co.，Ltd.）。外周血检测采用Sysmex-XT 4000i 全自动血细胞分析仪检测（Japan，Sysmex Corporation）。B超使用荷兰迈德彩色多普勒超声诊断设备和支持系统（Netherlands，Royal Dutch Philips Electronics Ltd.）。HBV-M 检测采用ROCHE 公司e601 全自动电化学发光免疫分析系统（Switzerland，Roche Diagnostics Products CO.，Ltd），试剂购自罗氏诊断产品（上海）有限公司的配套试剂（HBsAg 的稀释采用HBsAg-QN Dil HepB 在相应的平台强制稀释）。cobas HBV DNA 检测用ROCHE 公司全自动AmpliPrep/cobas TaqMan 48 系统检测仪，试剂使用ROCHE 公司的配套试剂（Switzerland，Roche Diagnostics Products CO.，Ltd），线性检测范围为2 ×101～1.7 × 108IU/mL。肝硬度采用法国ECHOSENS FIBROSCAN 仪器（France，ECHOSENS Co.，Ltd）进行肝硬度值（LSM，KPA）检测。CT 使用美国GE 公司64 排lightspeed VCT 机、AW4.3 工作站、perfusion-3.0 灌注软件包获得图像（the United States，General Electric Company）。MRI 使用上海联影3.0T 核磁共振成像系统-uMR780 进行扫描（China，Shanghai Lianying Medical Technology Co.，Ltd）。

1.5 统计学方法 使用EXCEL 表格收集原始资料，采用SPSS 25.0 进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t 检验；非正态分布的计量资料用M（P25，P75）进行描述，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验。计数资料用频数或率表示，两组间比较采用χ2检验。两组的D-D 水平分布符合正态分布，采用重复测量方差分析，采用Greenhouse-Geisser 法进行校正。当交互作用有统计学意义时进一步进行简单效应分析，组内各时间点之间的比较采用Bonferroni 法进行比较。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的基线情况 基线时Child-Pugh 分级［8］：观察组B 级99 例，C 级92 例，对照组：B 级78例，C 级87 例，两组间比较差异无统计学意义（χ2= 0.736，P = 0.391）；基线时肝硬化并发症：观察组自发性腹膜炎10 例、腹水17 例、肝性脑病2例、肝肾综合征6 例、上消化道出血4 例，对照组自发性腹膜炎8 例、腹水12 例、肝性脑病1 例、肝肾综合征5 例、上消化道出血4 例，两组间比较差异无统计学意义（χ2=0.340，P=0.987）；基线时合并高血压：观察组22 例，对照组17 例，两组间比较差异无统计学意义（χ2=0.134，P=0.714）；基线时合并糖尿病：观察组18 例，对照组18 例，两组间比较差异无统计学意义（χ2= 0.215，P = 0.643）。两组在性别、年龄、BMI、肝肾功能、D-D 等基线指标比较差异均无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 两组患者的基线特征Tab.1 Baseline characteristics of the two groups of patients M（P25，P75）

2.2 两组患者在治疗前、治疗6、12个月D-D水平分析 经S-W检验，各组数据均服从正态分布。重复测量数据的球形检验结查显示，MachlyW=0.645，显著性P＜0.001，不符合球形检验。因此以一元方差分析“Greenhouse-Geisser”中的校正结果为准。重复测量方差分析结果显示：两组间的主效应显著，F=58.953，P＜0.001，偏η2=0.143；时间的主效应显著，F=545.167，P＜0.001，偏η2=0.606；时间与组别的交互效应显著，F=10.117，P＜0.001，偏η2=0.028。表明两组之间差异有统计学意义、每组内三次D-D 水平间差异有统计学意义，同时组别和治疗时间存在交互作用。见表2。

表2 组别和时间对乙肝肝硬化患者D-二聚体水平的影响Tab.2 Effects of group and time on the level of D-dimer in patients with hepatitis B cirrhosis ±s

表2 组别和时间对乙肝肝硬化患者D-二聚体水平的影响Tab.2 Effects of group and time on the level of D-dimer in patients with hepatitis B cirrhosis ±s

注：a，交互效应

观察组对照组组别主效应时间主效应组别*时间a n 191 165基线3.44±1.33 3.59±1.30治疗6 个月1.70±0.65 2.44±0.88治疗12 个月1.09±0.40 1.63±0.62重复测量F 检验F 值58.953 545.167 10.119 P 值＜0.001＜0.001＜0.001偏η2 0.143 0.606 0.028

2.3 组别因素和时间因素的分别分析 组别因素的简单效应和时间因素的简单效应组别的简单检验效应结果显示：在干预前，两组间D-D 水平之间的简单效应不显著，F=1.130，P=0.289，偏η2=0.003；在治疗6 个月时两组的D-D 水平的简单效应显著，F=82.716，P＜0.001，偏η2=0.189；在治疗12 个月时两组的D-D 水平的简单效应显著，F=97.181，P＜0.001，偏η2=0.215。见表3。

表3 固定时间因素两个组别之间的比较Tab.3 Comparison between two groups at the same levels of time factor

时间的简单效应结果显示：在观察组中，基线时、治疗6 个月和治疗12 个月比较，时间因素的简单效应有统计学意义（F=288.459，P＜0.001）；在对照组中，基线时、治疗6 个月和治疗12 个月间比较，时间因素的简单效应亦有统计学意义（F= 207.913，P＜0.001）。观察组中基线、治疗6 个月和治疗12 个月的D-D 水平两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.001）；对照组中基线、治疗6 个月和治疗12 个月的D-D 水平两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见表4。

表4 时间因素不同水平的多重比较Tab.4 Multiple comparison among the levels of time factor

2.4 治疗时间与组别之间的交互轮廓图 治疗时间与组别间的交互轮廓图直观地反应了治疗时间与组别之间存在的交互效应。见图1。

图1 时间因素与组别因素的交互轮廓图Fig.1 Profile plot of time and grouping factors

2.5 两组患者的并发症和病死率情况 在对两组患者的药物治疗及抗病毒治疗的过程中，两组之间的新发腹水的发生率分别为4.19%、10.30%，差异有统计学意义（P=0.024）；新发的原发性自发性腹膜炎的发生率分别为1.57%、4.24%，差异没有统计学意义（P=0.128）；新发的上消化道出血的发生率分别为1.05%、4.85%，差异有统计学意义（P=0.030）；新发的PVT 的发生率分别为4.71%、10.30%，差异有统计学意义（P=0.043）；死亡率分别为0.52%、1.21%，差异无统计学意义（P=0.482）。见表5。

表5 两组患者的并发症及病死率情况比较Tab.5 Comparison of complications and mortality between the two groups 例

两组患者鼻出血发生率分别为2.09%、3.64%、牙龈出血发生率分别为1.57%、3.03%、皮肤出血发生率分别为1.05%、1.82%、便血发生率分别为1.05%、2.42%。

2.6 两组患者凝血功能的变化 收集到两组患者基线和治疗后的凝血功能指标，两组患者PT、APTT 治疗前后的差值的均值比较，差异有统计学意义（t=4.223，P＜0.001；t=5.910，P＜0.001）；而TT、INR 治疗前后的差值的均值比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表6。

表6 两组患者治疗前后凝血功能比较Tab.6 Comparison of blood function between the two groups before and after treatment ±s

表6 两组患者治疗前后凝血功能比较Tab.6 Comparison of blood function between the two groups before and after treatment ±s

观察组对照组t 值P 值PT（s）治疗前24.93±4.39 25.25±4.80治疗后18.45±4.01 21.32±4.12差值的均值6.48±1.41 3.93±1.48 4.223＜0.05 APTT（s）治疗前56.17±10.75 55.89±10.52治疗后45.67±8.24 50.52±8.59差值的均值10.5±1.89 5.37±1.79 5.91＜0.05 TT（s）治疗前25.36±5.31 25.13±5.25治疗后22.47±4.05 23.68±4.35差值的均值2.89±0.48 1.45±0.50 1.028 0.305 INR治疗前1.61±0.44 1.67±0.46治疗后1.35±0.31 1.46±0.43差值的均值0.26±0.04 0.21±0.05 1.14 0.255

3 讨论

本研究表明，HBC 患者单用ETV 与ETV 联用GS 治疗12 个月，均能有效的降低D-D 水平，且随着治疗时间的延长，D-D 水平降低越明显。同时，在各时间点上，ETV 联用GS 比单用ETV 降低D-D的幅度更明显，且PVT、腹水和消化道出血的发生率更低。

HBC 失代偿期患者的出血功能和凝血功能均明显异常，可能出现消化道出血、PVT 等严重并发症，患者死亡率极高，预后较差［11-12］。D-D 水平不同程度的升高，是肝硬化患者PVT、感染等的高危因素。研究显示，血浆D-D 水平升高与肝硬化患者CHILD-PUGH 分级和MELD 评分具有明显的正相关性，MELD 评分＞15 的患者其D-D 水平明显高于评分≤15 的患者，表明D-D 水平越高，肝硬化病情越重，病死率越高［13-15］。术前高D-D 水平也是腹部手术后门静脉血栓形成和预后不良的高危因素［16-17］。

本研究显示，对照组使用ETV6 个月和12 个月时，D-D 水平逐渐下降，表明ETV 可能通过抑制肝细胞炎症活动、修复肝内血管内皮细胞损伤等，从而发挥改善肝脏血流动力学的作用，最终达到改善肝脏功能障碍［18］，纠正HBC 失代偿所致的高凝状态，减少PVT 的风险。而观察组使用ETV 联合GS 治疗6 个月和12 个月时，D-D 比单用ETV 各时间点下降更明显，表明GS 在修复损伤的肝细胞、改善门静脉压力、缓解高凝状态等方面发挥了明显的作用。特别是组别的简单检验效应和时间的简单检验效应均有显著性差异，表明GS 在减轻HBC 患者高凝状态、修复肝细胞功能方面具有显著的作用。显示出联合治疗能在更短时间内更成功地影响HBC 患者的出凝血状态和肝脏门静脉血流动力学，甚至可能改善HC 的组织学或逆转肝纤维化。

GS 组方以柴胡、党参为君药，白术、当归、丹参、虎杖为臣药，茯苓、白芍、桃仁、鳖甲、蒲公英、夏枯草、枳壳为佐药。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷能明显降低肝纤维化大鼠透明质酸、层黏蛋白和Ⅵ型胶原含量［19］。党参提取物的主要活性成分黄酮类可以降低D-D 浓度、有效地防止缺氧诱导的血小板活化和产生的促凝血状态［9，20］。而丹参的主要活性成分丹参酮参酮Ⅱ-A、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参单体IH764-3 能改善血液流变学障碍、血管内皮功能、抑制血小板聚积和粘附等，从而多途径改善高凝状态［21］。白术内酯化物减少激动剂诱导的血小板聚集和降低三磷酸腺苷从致密颗粒中释放，从而抑制血小板活化［22］。有研究证实，GS 的主要活性成分经高效液相色谱分析鉴定为柚皮苷，而柚皮苷可以诱导自噬的激活，减轻肝细胞损伤，还可能通过MTOR 途径抑制HSC 活化，从而达到抗纤维化的作用［23］。LU 等的研究［24］证实，ETV 联合GS 能更多的改善CHB 引起的晚期纤维化和HBC 肝组织学。也有学者发现，GS 组的白细胞介素6、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β 的表达水平更高，而转化生长因子-β1 的表达则下降，GS 可能通过部分抑制调节性T 细胞分化发挥重要的抗纤维化作用，这有助于肝脏再生和修复［25］。刘立等［26］观察到，GS 联合富马酸替诺福韦酯能更好地改善HBC 的门静脉血流动力学指标如DPV、VPV、QPV 等。可见，GS 的活性成分可能通过诱导激活自噬、抑制HSC 活化、抑制调节性T 细胞分化、改善血管内皮功能、抑制血小板聚积和粘附、改善肝内微循环、提高门静脉系统血流速度等多靶点影响肝脏组织学和血流动力学状态，从而改善HBC 的高凝状态、降低D-D 水平。尽管如此，GS在不联合抗病毒药物的情况下对HBC 患者是否能够有效改善肝脏纤维化和血流动力学状态尚需要更多的证据来证实。

两组间新发腹水、上消化道出血和PVT 的发生率有明显差别亦表明血流动力学、门静脉压力和纤维化的改善联合组优于对照组。新发的原发性自发性腹膜炎和死亡的发生率两组间没有差别，表明两组在减少细菌感染方面类似。在减少死亡方面，观察组出现1 例死亡，对照组出现2 例死亡，由于绝对数少，可能还需要更多的数据或更长时间的观察。

本研究的局限为单中心的数据，需要更多的中心予以证实。

总之，本研究结果显示GS 联合ETV 对HBC 高凝状态的患者D-D 的降低作用显著，对于HBC 患者PVT 有明显的预防作用。特别是对临床上肝功能失代偿、有PVT 高风险且抗凝药物禁忌症的患者，GS 具有一定的优势，也避免了抗凝药物引起的出血等风险，值得在临床中进一步推广应用。下一步有必要对GS 联合ETV 治疗HBC 患者的PVT 的远期发生率、死亡率进行深入的追踪研究。