lncRNAH19/Sirt3介导自噬在脑出血后损伤中的作用机制

袁敏 王素洁 李茜 张志月

唐山市工人医院（河北医科大学附属唐山临床医学院）（河北唐山063000）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种可致命的卒中亚型，由自发性非创伤性出血进入脑实质引起［1］。目前，脑出血尚无有效的治疗策略，迫切需要确定针对脑出血的精确机制。自噬被认为是细胞克服外部刺激损伤的自我保护机制，其促进细胞在各种病理过程中的存活［2-4］。全基因组测序技术表明，脑出血影响了各种非编码RNA（ncRNA）的表达［5］。作为调节性ncRNA，lncRNA（＞200 nt）通过调节发育和疾病相关基因参与某些疾病的发生、发展和病理过程［6-7］。有证据表明，lncRNA H19（以下简称H19）是在人脑灰质和白质中表达稳定性最高的10 种lncRNA 之一［8］。H19 在许多中枢神经系统疾病中发挥重要作用，例如H19通过转录和转录后调控参与颅内动脉瘤的病理生理过程［9］。最近，KIM 等［10］揭示H19 在脑出血后高表达，表明H19 可能作为脑出血的生物标志物。还有文献表明，H19 与自噬相关的miRNA 或蛋白质相互作用［11-12］。然而，H19 是否参与脑出血损伤病理过程中自噬调节的机制需要进一步探索。因此，本研究通过体内建立脑出血小鼠模型和体外将SH-SY5Y 细胞暴露于氧血红蛋白（OxyHb）模拟脑出血，共同探讨H19 在脑出血损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 84 只成年C57BL/6J（B6）小鼠（8 ～10 周，25 ～30 g，雌性各半）购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号SCXK（京）2019-0008）。小鼠在特定的无病原体条件下，允许随意获取食物和水。

1.1.2 试剂 胶原酶Ⅳ、MTT 溶液购自美国Sigma-Aldrich 公司；抗LC3、Beclin、p62、Sirt3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTORβ-actin 和HRP 偶联的二抗购自英国Abcam 公司；Cy3 标记的山羊抗兔Ig G 购自 上 海Beyotime 公司；OxyHb 购自德国Ruibio 公司；Lipo2000 购自美国Invitrogen 公司；总RNA 提取试剂盒购自北京Solarbio 公司；PrimeScript RT 试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix 购自日本Takara 公司；ECL化学发光系统购自美国Thermo Fisher公司。含有sh-H19 或sh-NC 的慢病毒载体购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。

1.1.3 细胞 SH-SY5Y 细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，接种在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基中培养。

1.2 体内实验

1.2.1 脑出血模型建立 参照文献方法通过注射胶原酶Ⅳ诱导脑出血模型［13］。具体操作为：小鼠麻醉后固定在立体定向框架中，并在头部前囟点（前0.5 mm 和左侧纹状体部分外侧2 mm）钻一个孔。将溶解在0.5 μL 生理盐水中的总共0.06 单位胶原酶Ⅳ以0.18 μL/min 的速度注射到左侧纹状体中。输注后将针头保持原位10 min 以防止回流。

1.2.2 小鼠分组 将小鼠分为6 组：假手术（Sham）组、脑出血（ICH）组、Sham+shRNA 阴性对照（sh-NC）组，Sham+shRNA-H19（sh-H19）组，ICH+sh-NC组和ICH+sh-H19 组。Sham 组（n= 18）：除了不注射胶原酶Ⅳ，其余同1.2.1 方法；ICH 组（n=18）：按照1.2.1 方法建立脑出血模型；Sham+sh-NC 组、Sham+sh-H19 组：在假手术前72 h，分别将含有sh-NC（1 × 108TU/mL）和sh-H19（1 × 108TU/mL）的慢病毒颗粒10 min内缓慢注射到小鼠脑室中（10 μL，速率为0.5 μL/min）；ICH+sh-NC 组、ICH+sh-H19组：在脑出血建模（同ICH 组）前72 h，分别将含有sh-NC（1×108TU/mL）和sh-H19（1×108TU/mL）的慢病毒颗粒10 min 内缓慢注射到小鼠脑室中（10 μL，速率为0.5 μL/min）。体内实验分为两部分：（1）脑出血后小鼠脑组织中H19 表达的时程分析：观察Sham 组和ICH 组脑出血建模术后24、48 和72 h H19 表达水平。（2）确定H19 在脑出血中的作用及其潜在机制：脑出血后48 h，Sham+sh-NC 组、Sham+sh-H19 组、ICH+sh-NC 组和ICH+sh-H19 组每组6 只小鼠被处死并分离病灶脑组织用于后续分析，其余6 只小鼠用于神经行为分析。

1.2.3 病灶体积评估 在神经学评估后，处死模型小鼠并将大脑切成2 mm 厚的冠状切片，参照文献方法评估病变体积（n=3）［13］。总病灶体积=4×每个脑切片的病灶体积×2 mm。

1.2.4 行为分析 采用量化改良神经严重程度评分（modified neurological severity score，mNSS）评估每只小鼠的神经功能缺损。

1.2.5 免疫荧光 给予脑切片以回收抗原，然后脱水，透化并与0.2%牛血清白蛋白孵育，将脑切片与抗LC3（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育过夜。次日，在室温下将Cy3 标记的山羊抗兔Ig G（1∶200）添加到切片中孵育1 h。然后将切片用DAPI 染色。使用倒置荧光显微镜捕获图像。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞分组 将SH-SY5Y 细胞以约1.2 × 106的密度接种至6 孔板中，为了模拟脑出血，将SHSY5Y 细胞暴露于10 μmol/L 浓度下OxyHb［14］。将细胞分为对照（Control）组、H19 敲低组（sh-H19）、OxyHb 组、OxyHb+sh-NC 组、OxyHb+sh-H19 组、OxyHb+sh-Sirt3 组 和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 组。Control 组：SH-SY5Y 细胞中加入空白溶剂；sh-H19组：采用sh-H19转染SH-SY5Y细胞48 h；OxyHb组：SH-SY5Y细胞中加入10 μmol/L浓度OxyHb；OxyHb+sh-NC组、OxyHb+sh-H19组和OxyHb+sh-Sirt3组：将sh-NC、sh-H19或sh-Sirt3转染SH-SY5Y细胞48 h，然后加入10 μmol/L OxyHb处理细胞；OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 组：将sh-H19 和sh-Sirt3 转染SH-SY5Y细胞48 h，然后，加入10 μmol/L OxyHb 处理细胞。体外实验分为4 部分：（1）暴露于10 μmol/L 浓度OxyHb的SH-SY5Y 细胞中H19 表达的时程分析：观察Control 组和OxyHb 组暴露OxyHb 后24、48 和72 h的H19 表达水平。（2）确定H19 敲低对OxyHb 诱导的神经细胞损伤的影响：OxyHb 处理48 h，测定Control 组、OxyHb 组、OxyHb+sh-NC 组和OxyHb+sh-H19 组的细胞凋亡。（3）测定H19 敲低后的SHSY5Y 细胞RNA 序列：Control 组和sh-H19 组在转染48 h 进行RNA 测序。（4）观察H19 敲低对Sirt3 介导AMPK/mTOR 信号通路影响：OxyHb 处理48 h，Oxy-Hb组，收集OxyHb+sh-H19组，OxyHb+sh-Sirt3 组和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3组细胞用于信号通路分析。

1.3.2 细胞活力测量 SH-SY5Y 细胞加入MTT 溶液（0.5 mg/mL）并在37 ℃下孵育4 h。然后在黑暗中将紫色晶体溶解在150 μL DMSO 中10 min。在酶标仪上获得570 nm 处的光密度。

1.3.3 RNA 提取和RT-qPCR 分析 使用总RNA提取试剂盒从脑组织和SH-SY5Y 细胞中提取总RNA。然后使用PrimeScript RT 试剂盒对2 μg RNA样本进行反转录，并在CFX96 实时系统（Bio-Rad）上使用SYBR Green PCR Master Mix 进行RT-qPCR扩增。H19的表达水平标准化为β-actin。使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化。本研究中使用的引物如下：H19，F：5'-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3'和R：5'-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3'；β-actin，F：5'-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3'和R：5'-TGGACTCCACGACGTACTC-3'。

1.3.4 免疫印迹分析 通过使用RIPA 裂解缓冲液从组织和细胞中分离总蛋白。蛋白质样品进行电泳并转移到PVDF膜上。在5%脱脂牛奶中封闭后，将膜与靶向β-actin（1∶2 000），Beclin（1∶1 000），LC3（1∶1 000），p62（1∶1 000），Sirt3（1∶500），p-AMPK（1∶500）、AMPK（1∶500）、p-mTOR（1∶500）和mTOR（1∶1 000）的一抗在4 ℃下孵育过夜。然后将膜与HRP 偶联的二抗（1∶5 000）一起温育1 h，并用ECL 化学发光系统观察条带。

1.3.5 Tunel 染色 冷冻切片和细胞使用0.25%Triton X-100 透化15 min。每个切片在室温下用100 μL 平衡缓冲液孵育20 min，然后用50 μL 重组末端脱氧核苷酸转移酶（RTdT）孵育缓冲液覆盖并在37 ℃下黑暗中孵育1 h，再用DAPI 染色15 min。使用倒置荧光显微镜捕获图像，并对脑出血部位周围的阳性细胞进行计数。

1.3.6 RNA测序 从SH-SY5Y中提取的RNA（4 μg）用DNase 处理，去除核糖体RNA 后，制备RNA 文库。在HiSeq 2000 系统（美国Illumina 公司）上进行RNA 测序。使用Bioconductor R 程序中的EBSeq程序包评估差异基因表达。运用注释、可视化和集成发现数据库对差异表达的mRNA 进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

1.4 统计学方法 使用GraphPad Prism 7.0 进行统计分析。计量资料表示为均数±标准差，两组之间比较用t检验，多组比较用方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H19 在体内和体外脑出血时高度表达 与Sham 组相比，ICH 组在模型建立后第2 天病灶体积显著增加（P＜0.001），并且mNSS 得分显著较高（P＜0.001，图1A-C）。脑出血后H19 的表达呈时间依赖性上调（均P＜0.05，图1D），并且H19 表达也在OxyHb 处理细胞中以时间依赖性方式增强（均P＜0.05，图1E）。

图1 H19 在体内和体外脑出血时高度表达Fig.1 H19 was highly expressed during ICH in vivo and in vitro

2.2 H19敲低减轻脑出血引起的神经损伤 sh-H19显著降低损伤区域的H19 表达（图2A）。与ICH+sh-NC 组相比，ICH+sh-H19 组在模型建立后第2 天病灶体积和mNSS 评分均显著降低（P＜0.01），并且神经元细胞凋亡显著减少（P＜0.01，图2B-E）。

图2 H19 敲低减轻脑出血引起的神经损伤Fig.2 H19 knockdown attenuated ICH-induced nerve damage

2.3 H19 敲低增强脑出血小鼠脑内自噬 损伤区域LC3 的强度因脑出血而增加，而H19 敲低进一步增强了LC3 的强度。见图3。

图3 H19 敲低增强脑出血小鼠脑内自噬Fig.3 H19 knockdown enhanced autophagy in the brain of ICH mice

2.4 H19敲低减轻OxyHb诱导的神经细胞损伤诱导脑出血后，细胞中H19 表达升高，并且细胞活力降低（图4A-B）。由脑出血诱导的凋亡细胞增加被H19 敲低所缓解（图4C-D）。此外，H19 敲低可增加LC3II/LC3I 和Beclin 水平，降低p62 蛋白水平（图4E）。

图4 H19 敲低减轻OxyHb 诱导的神经细胞损伤Fig.4 H19 knockdown attenuated OxyHb-induced neuronal injury

2.5 H19 敲低通过增强Sirt3 介导AMPK/mTOR信号通路促进自噬水平 与对照组相比，H19 敲低组中有1 120 个mRNA 差异表达，其中429 个上调mRNA 和691 个下调mRNA。mRNAs 的差异表达水平通过火山图直观表达（图5A）。KEGG 通路分析显示，差异表达的mRNA 在AMPK/mTOR 信号通路中富集，这与自噬调节有关（图5B）。Sirt3 通过AMPK/mTOR 途径在调节细胞防御和介导细胞存活中发挥重要作用。OxyHb 诱导Sirt3水平升高，H19敲低进一步提高Sirt3水平。在OxyHb 诱导后，p-AMPK/AMPK 比率升高，而p-mTOR/mTOR 比率下降。H19 敲低大大加剧了上述变化（图5C）。H19敲低细胞中的Sirt3 敲低逆转了升高的p-AMPK/AMPK 比率和降低的p-mTOR/mTOR 比率（图5D）。

图5 H19 敲低通过增强Sirt3 介导AMPK/mTOR 信号通路促进自噬水平Fig.5 H19 knockdown promoted autophagy levels by enhancing Sirt3-mediated AMPK/mTOR signaling pathway

2.6 H19 敲低通过调节Sirt3 诱导的自噬减轻脑出血损伤 H19 敲低细胞中提高的细胞活力在Sirt3 敲低后得到降低，并且减少的细胞凋亡在Sirt3 敲低后得到增强（图6A-C）。此外，Sirt3 敲低降低了H19 敲低细胞中增加的细胞自噬（图6D）。

图6 H19 敲低通过调节Sirt3 诱导的自噬减轻脑出血损伤Fig.6 H19 knockdown attenuated ICH injury by regulating Sirt3-induced autophagy

3 讨论

研究表明，H19 在脑出血发展过程中发挥了关键作用［15］。H19 可以通过促进miR-675 的表达和靶向VEGF 来增加与脑血管痉挛有关的HIF-1α mRNA 和蛋白质水平。颅内动脉瘤是脑出血的主要原因，H19 通过转录和转录后调控参与颅内动脉瘤的病理生理过程［9］。此外，H19 也是腹主动脉瘤形成的诱发因素，并通过将SP1 募集到缺氧诱导的因子1α 启动子区域来促进其转录，从而诱导平滑肌细胞凋亡［16］。同样，ZHANG 等［17］发现H19可以通过Wnt/β-catenin 信号通路充当miR-148b 的分子海绵，从而调节人主动脉血管平滑肌细胞的增殖和凋亡。基于以上证据，本研究通过体内外构建脑出血模型证实了H19 在脑出血小鼠模型中的表达升高，和H19 敲低可以减轻脑出血引起的神经损伤，并在机制研究中发现其损伤机制可能与抑制自噬有关。

大量证据表明，脑出血细胞损伤的严重程度受自噬的影响，激活自噬可以通过降解受损蛋白质诱导新蛋白质的合成［18-19］。一些研究者报道，自噬可以减少脑出血后的梗死体积、神经元死亡和神经功能障碍［20］。本研究发现，脑出血损伤期间自噬被激活，并且H19 敲低进一步增加自噬水平。通过mRNA 测序，对照组和H19 敲低组差异表达的mRNA 在AMPK/mTOR 信号通路中富集。AMPK/mTOR 信号通路是自噬过程的经典调控通路，先前研究证实Sirt3 通过AMPK-mTOR 途径诱导自噬［21-22］。Sirt3 属于人类sirtuin 家族最保守和最具特征的一个成员，在调节系统大脑中能量稳态和细胞寿命方面起着至关重要的作用［23］。本研究发现H19 敲低增加了Sirt3 水平，并且H19 敲低通过调节Sirt3 诱导的自噬减轻了OxyHb 处理后SH-SY5Y 细胞损伤。因此，笔者认为H19 可能在脑出血模型中通过抑制Sirt3 介导的AMPK-mTOR信号通路来抑制自噬激活。

综上所述，本研究发现H19 在体内外脑出血模型中以时间依赖性方式增强，H19 敲低可以减少脑出血病灶体积，减轻神经损伤和减少神经元凋亡。此外，H19 敲低促进了Sirt3 的表达，进而通过激活AMPK-mTOR 信号通路增强自噬。这些结果揭示了H19 有可能成为脑出血治疗的一个关键靶点，这也为开发新的脑出血治疗方法提供了基础。然而，脑出血是一个复杂的调控体系，本课题组后续实验将进一步阐明H19 是否通过其他途径介导脑出血进展，并在临床大样本中验证。