泛素结合酶E2T基因干扰影响人卵巢癌细胞株SKOV3增殖的作用与机制

李馨 张瑜 倪婷婷 鲁亮

贵州省人民医院肿瘤科（贵阳550002）

卵巢癌是指起源于卵巢的恶性肿瘤，调查显示［1］我国近10年来卵巢癌的发病率已增长30%，且仍呈增长趋势。另有研究［2-3］显示，约有70%的卵巢癌患者确诊时已处于晚期，5年生存率低于30%。靶向治疗［4-5］是指在细胞分子水平上针对明确的致癌位点设计相应的治疗药物，使其能够特异性与致癌位点结合促使肿瘤细胞凋亡，是一种新型、高效、安全的治疗技术，也是目前抗肿瘤治疗研究的热点。但是目前人们对卵巢癌发病机制仍缺乏深入的认识，对靶向治疗的研究也仅仅处于起步阶段。

泛素结合酶E2T（UBE2T）是泛素结合酶E2 家族中的重要成员，已有大量研究证实该分子与细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生发展密切相关［6-7］。UBE2T 可促使抑癌基因泛素化，降解抑癌基因表达的蛋白，促使恶性肿瘤细胞增殖；UBE2T 还可激活其下游的蛋白激酶B（AKT）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1），增强二者的表达，促进细胞G1 期到S期的转化，增强细胞增殖活性［8-9］。有实验证实［10］采用药物降低癌细胞UBE2T 的表达有助于抑制细胞增殖。另有研究［11］表明UBE2T 可调控三阴性乳腺癌细胞株的增殖、迁移和侵袭。据此推测UBE2T基因异常表达可能参与恶性肿瘤的发生和发展。然而目前关于UBE2T 基因干扰是否可通过抑制AKT 和Cyclin D1 的表达及其生物学作用从而影响人卵巢癌细胞株SKOV3 的增殖尚未可知。故此本研究进行细胞实验，旨在为卵巢癌靶向治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 人卵巢癌细胞株SKOV3（北京生命科学研究所，批号：CC19011136）；慢病毒包装质粒（美国Sigma 公司，批号：1904152A）。

1.1.2 主要试剂 AgeI 酶、EcoRI 酶（美国NEB 公司，批号：1812117、1810145）；puromycin 溶液（上海信帆生物科技有限公司，批号：1811075012）；Trizol试剂盒、蛋白抽提试剂盒（美国Thermo 公司，批号：1901145001、1902183007）；噻唑蓝（MTT）试剂盒（美国Sigma公司，批号：1902138C）；鼠抗人UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT单克隆抗体、兔抗鼠UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT 多克隆抗体（酶标记）（Abcam 中国公司，批号：2018172、2019103、2019015、2019041、2019112、2019045、2019158、2019116）；UBE2T-shRNA 序列、UBE2T、AKT、Cyclin D1 引物序列均委托宝生物（大连）科技有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 EasyCycler 96 聚合酶链反应（PCR）仪（德国耶拿公司）；CX23 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；LWD300-38CLFT 型倒置显微镜（西安测维光电技术有限公司）；CFM-100A 型荧光显微镜（上海长方光学仪器有限公司）；CytoFLEX S 型流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、传代、分组及干预 取人卵巢癌细胞株SKOV3 将其复苏后置入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中培养，然后离心弃去上清液，再次加入适量培养液并将细胞吹打均匀，移液至培养皿中，拧松瓶口，至于37 ℃、5%浓度二氧化碳、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2 ～3 d，观察细胞传代情况。参照shRNA 的基本设计原则设计shRNA 序列［12］。构建UBE2T-shRNA、携带UBE2T、NC-shRNA 基因的慢病毒载体，将其转染至人卵巢癌细胞株SKOV3，分别记为沉默组、转染组、阴性对照组；并取未转染的人卵巢癌细胞株SKOV3，记为空白对照组。每组设置3 个复孔，制成细胞悬液，细胞浓度均调整为1×105个/mL。荧光显微镜下观察各组细胞转染效率，且均用含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养72 h。

1.2.2 UBE2T 基因干扰效率鉴定 （1）采用RTqPCR 检 测UBE2T mRNA 表达，UBE2T 引物上游：5'-TGATCGATATGCGGCGAATTAGCTAG-3'，下游：5'-CGATTAGCGGCGAGAGAGTAGCTAGC-3'，扩增片段长度：278 bp；内参β-actin 引物上游：5'-TAGCTTGGCTAGAGCTGAGC-3'，下游：5'-AGGCTAGAGCTATAGCTATG-3'，扩增片段长度：202 bp。采用Trizol 法提取细胞总RNA，提纯定量，逆转录为cDNA。配置反应体系，包括去离子水10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，预混液（GoTaq®qPCR Master Mix）7.2 μL，共20 μL。PCR反应流程：94 ℃（2 min），40个循环：94 ℃（15 s），60 ℃（1 min），最后95 ℃（1 min）、冷却至55 ℃。计算2-△△Ct。（2）采用Western blot 检测UBE2T 蛋白表达：加入裂解液，提取细胞总蛋白。取40 μg 总蛋白及蛋白标志物3 μL上样，将电泳槽置于冰上电泳。根据预染的标志物分子量在分离胶上确定目的蛋白的位置，将多余的凝胶去除，100 V 转膜1 h。转膜，并将一抗按照相应倍数稀释，将转膜后的样品置于一抗工作液，4 ℃过夜；洗膜后置入二抗工作液中摇床孵育2 h，室温。洗膜、化学发光，显影、定影和分析。

1.2.3 细胞形态学观察及增殖抑制率检测 （1）各组细胞培养72 h 后，倒置显微镜下观察细胞形态学变化；（2）MTT 法检测细胞增殖抑制率。向每孔中加入MTT 试剂（5 g/L）共10 μL，连续培养4 h后向其中加入十二烷基硫酸钠100 μL，采用多功能微孔板测试系统检测570 nm 波长处的光密度（OD）值，计算增殖抑制率=（OD对照-OD观察）/OD对照×100.00%。

1.2.4 细胞周期检测 采用流式细胞仪检测细胞周期。各组细胞培养72 h 后收集细胞，制成单细胞悬液，取70%冰乙醇（4 ℃）固定，以灭菌的磷酸盐缓冲液清洗、离心，撇去上清液后加入RNAase 150 μL 和碘化丙啶（PI）染液150 μL，室温下避光染色30 min。离心，撇去上清液，以磷酸盐缓冲液重悬后上机检测。

1.2.5 AKT、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达及p-AKT水平检测 AKT、Cyclin D1 mRNA 表达检测参照1.2.3 中RT-qPCR 步骤，其中AKT 引物上游：5'-TAGCATAGCGGCGGATAGCA-3'，下游：5'-CTAGAGCGGCGCGATACTAG-3'，扩增片段长度：246 bp，Cyclin D1 引物上游：5'-ATAGCGGCGGATAGCGGCGAGAGATC-3'，下游：5'-AAAGAGGCGGAGAGCTGCGAGAGGAG-3'，扩增片段长度：310 bp。AKT、Cyclin D1 蛋白表达及p-AKT 水平检测参照1.2.3 中Western blot 步骤。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，比较采用方差分析和SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 puromycin 最优浓度筛选结果 将puromycin 2.0 μg/mL 作为人卵巢癌SKOV3 细胞加压筛选的最优浓度，见表1。

表1 人卵巢癌细胞株SKOV3 细胞对puromycin 的药敏实验结果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

表1 人卵巢癌细胞株SKOV3 细胞对puromycin 的药敏实验结果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

puromycin浓度0 μg/mL 0.5 μg/mL 1.0 μg/mL 1.5 μg/mL 2.0 μg/mL 2.5 μg/mL例数3 3 3 3 3 3 48 h细胞凋亡率（%）0 14.25±2.18 22.74±4.06 31.82±5.97 58.76±6.13 71.22±7.34 72 h细胞凋亡率（%）0 23.57±4.15 30.35±5.19 51.28±6.90 100 100

2.2 转染率结果 阴性对照组、沉默组、转染组荧光视野均见转染细胞，转染率分别为（91.06 ±8.71）%、（94.61 ± 10.55）%、（93.25 ± 11.36）%，见图1。

图1 各组细胞荧光图（×200）Fig.1 Cell fluorescence diagram of each group（×200）

2.3 UBE2T 基因干扰效率鉴定结果 转染组UBE2T mRNA 及蛋白表达均高于其余3 组（P＜0.05），沉默组UBE2T mRNA 及蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05），见表2。

表2 各组UBE2T mRNA 及蛋白表达对比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

表2 各组UBE2T mRNA 及蛋白表达对比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与阴性对照组比较，bP ＜0.05；与沉默组比较，cP ＜0.05

组别空白对照组阴性对照组沉默组转染组F 值P 值例数3 3 3 3 UBE2T mRNA 表达1.43±0.21 1.40±0.20 0.55±0.07ab 1.69±0.31abc 32.506＜0.001 UBE2T 蛋白表达1.02±0.15 0.98±0.16 0.27±0.05ab 1.73±0.33abc 21.228＜0.001

2.4 各组细胞形态学变化 空白对照组、阴性对照组、转染组均可见细胞连接紧密，聚集片状生长，透光性良好；沉默组可见细胞呈圆形或类圆形，排列紊乱，形态多变，相对分散，细胞内颗粒感增强，透光性差，细胞间界限模糊且存活细胞少，见图2。

图2 各组细胞形态学变化（倒置相差显微镜，×200）Fig.2 Morphological changes of cells in each group（inverted phase contrast microscope，×200）

2.5 各组细胞增殖抑制率对比 空白对照组、阴性对照组、沉默组、转染组细胞增殖抑制率分别为0、（0±0.01）%、（38.71±9.15）%、（-32.56±6.13）%，沉默组均高于其余3 组（P＜0.05），转染组低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。

2.6 各组细胞周期观察对比 沉默组G1 期高于其余3 组（P＜0.05），S 期和G2 期均低于其余3 组（P＜0.05），转染组G1 期低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），S 期和G2 期均高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），见图3、表3。

图3 各组细胞周期流式细胞仪检测Fig.3 Cell cycle detection by flow cytometry in each group

表3 各组细胞周期对比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

表3 各组细胞周期对比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与阴性对照组比较，bP ＜0.05；与沉默组比较，cP ＜0.05

组别空白对照组阴性对照组沉默组转染组F 值P 值例数3 3 3 3 G1 37.63±6.82 39.85±5.71 69.65±7.88ab 28.45±4.68abc 49.173＜0.001 S 49.63±8.51 51.88±9.02 24.69±4.51ab 54.68±10.12abc 41.205＜0.001 G2 13.50±2.41 12.75±2.57 6.05±1.08ab 16.87±3.05abc 8.195 0.001

2.7 各组细胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表达和AKT、Cyclin D1 蛋白表达及p-AKT 对比 沉默组细胞AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表达，p-AKT水平均低于其余3 组（P＜0.05），转染组AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表达，p-AKT 水平均高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），见表4。

表4 各组细胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表达、AKT、Cyclin D1 蛋白表达及p-AKT 对比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

表4 各组细胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表达、AKT、Cyclin D1 蛋白表达及p-AKT 对比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与阴性对照组比较，bP ＜0.05；与沉默组比较，cP ＜0.05

组别空白对照组阴性对照组沉默组转染组F 值P 值例数3 3 3 3 AKT 1.22±0.24 1.24±0.25 0.83±0.12ab 1.36±0.28abc 27.168＜0.001 Cyclin D1 1.17±0.23 1.14±0.26 0.56±0.09ab 1.42±0.26abc 22.305＜0.001 AKT 蛋白1.28±0.24 1.31±0.26 0.69±0.11ab 1.65±0.3abc 49.865＜0.001 Cyclin D1 蛋白0.72±0.11 0.76±0.13 0.38±0.05ab 1.03±0.22abc 28.763＜0.001 p-AKT 0.32±0.05 0.30±0.04 0.17±0.03ab 1.18±0.24abc 7.502 0.002

3 讨论

本研究通过构建UBE2T-shRNA 载体并以慢病毒包装可整合进入基因组并保持长效转染，还转染携带UBE2T 基因的质粒介导人卵巢癌细胞株SKOV3 基因转染从而实现UBE2T 的基因干扰。此外，本研究经不同浓度的puromycin 作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，发现细胞加压筛选的最优浓度为2.0 μg/mL，为后期获得高转染率奠定了基础。本研究阴性对照组、沉默组和转染组的转染率均较高，提示获得了稳定表达株；沉默组UBE2T mRNA 与蛋白表达均显著低于其余3 组，且转染组UBE2T mRNA 与蛋白表达均显著高于空白对照组和阴性对照组，表明前期工作已顺利完成。

本研究发现UBE2T 基因沉默可促使人卵巢癌细胞株SKOV3 发生形态学改变，抑制其增殖，且主要是通过阻滞细胞从G1 期向S 期分化实现此作用的；而UBE2T 基因转染则可起反作用。UBE2T 属于泛素蛋白酶降解系统，可参与细胞信号传导、细胞周期调控、细胞增殖和凋亡等［13］。有实验报道显示［14］，UBE2T 基因转上调人结直肠癌细胞株中UBE2T 蛋白表达发现其水平升高，同时细胞的增殖能力增强，本研究结果与其具有一致性；此外，有研究［15］利用si-UBE2T 载体沉默鼻咽癌细胞系5-8F 细胞中UBE2T 蛋白表达可降低OD值，同时还可减弱细胞迁移与侵袭能力，本研究报道与其相符；另有临床研究发现肺腺癌组织中UBE2T 蛋白表达高于癌旁正常组织，且与临床分期等密切相关［16］。

本研究表明UBE2T 基因沉默很可能是通过下调AKT、Cyclin D1 mRNA 与蛋白表达和p-AKT 水平实现抑制人卵巢癌细胞株SKOV3 增殖，抑制G1 期向S 期分化的；而UBE2T 基因转染的作用正相反。有研究表明［17］，UBE2T 是泛素传递网络中的关键，可通过经典的信号调控通路影响恶性肿瘤的发生和发展。CHEN 等［18］报道显示，UBE2T 基因高表达与癌症的发生和发展相关。AKT 和Cyclin D1 均位于UBE2T 的下游，二者在细胞存活、增殖与凋亡过程中均有重要的调控作用［19］。有报道［20］发现，UBE2T可正向调控AKT的表达，沉默UBE2T基因表达可下调后者的表达，同时还可降低p-AKT 水平，推测可通过此途径抑制恶性肿瘤细胞增殖。本研究结果与上述报道和分析均一致。

综上所述，UBE2T 基因沉默可抑制人卵巢癌细胞株SKOV3 增殖和G1 期向S1 期分化，推测是通过抑制UBE2T、AKT、Cyclin D1 mRNA 与蛋白表达和p-AKT 水平实现此作用的。但沉默UBE2T 是否能够对体内接种SKOV3 肿瘤生长产生抑制作用尚不清楚，且调控UBE2T 基因是如何调控其下游的AKT、Cyclin D1 表达的尚未阐明，后期仍需要进一步探讨。