miR-146a-5p对炎症反应因子及脂代谢因子的调节作用

孙雅楠 李斯 尹明洁 (唐山市工人医院 内分泌二科，河北 唐山 063000；心内四科)

2型糖尿病(T2DM)目前被认为是一种慢性低度炎症反应，主要由于营养物质堆积所触发的肝脏、胰腺等组织细胞的炎症反应〔1,2〕，能够导致葡萄糖及脂质代谢紊乱并降低机体对胰岛素的敏感性。研究显示T2DM患者机体脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎症因子水平较健康人群显著升高〔3～5〕。miR-146a-5p基因位于人第5号染色体，是第一个被发现具有免疫调节功能的miRNA，研究显示在T2DM患者外周血单个核细胞中miR-146a-5p表达水平显著降低，并且miR-146a-5p能够通过炎症诱导调节胰岛细胞凋亡〔6,7〕，在牙龈卟啉单胞菌(P.g)LPS诱导的HepG2细胞炎性反应时，miR-146a-5p表达量增加是否对细胞中白细胞介素受体相关激酶(IRAK)-1、胆固醇代谢相关因子ATP结合盒转运蛋白(ABC)G1蛋白表达水平产生影响，尚未见文献报道。本研究以HepG2细胞为研究模型，分别以P.gLPS刺激、miR-146a-5p-mimics转染为干预手段，探讨在细胞炎症反应状态下miR-146a-5p对炎症反应及脂质代谢因子的调节作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 HepG2细胞系由中国协和医科大学基础研究所细胞中心提供。

1.2实验分组 实验分为4组：HepG2细胞体外P.gLPS刺激为P.gLPS刺激组；HepG2细胞体外转染miR-146a-5p-mimics为miR-146a-5p转染组；He-pG2细胞体外转染miR-146a-5p-mimics后经P.gLPS刺激为miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组；阴性对照组未经P.gLPS刺激未转染miR-146a-5p-mimics，其他培养条件与各组相同。

1.3细胞培养 将复苏后的HepG2细胞加入适量含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成105/ml浓度移至培养瓶中，置于37%CO2培养箱内培养，次日更换培养液，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞生长铺满瓶壁即可传代。

1.4细胞刺激与转染 P.gLPS刺激：P.gLPS刺激组与miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组分别加入P.gLPS的浓度为1 μg/ml，培养6 h收获细胞，用于后续实验。miR-146a-5p-mimics转染：将配制好的miR-146a-5p-mimics转染复合物250 μl，加入培养好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培养基750 μl/孔，加入各孔中，前后轻柔摇动细胞板至混合均匀。将细胞培养板置于 37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。转染6 h后吸取1 ml普通DMEM培养基(含有20%胎牛血清、无抗生素)，加入各孔。

1.5Western印迹 细胞转染完成后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后应用放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解获得细胞总蛋白，应用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，之后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳过后取目的蛋白条带恒流200 mA，转膜1 h。转膜完成后，将膜用TBST水洗，放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗体与一抗稀释液，将封闭好的膜放入配好的一抗稀释液，4℃摇床过夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗与二抗稀释液，将膜放入配好的二抗稀释液，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.6考马斯亮蓝法测蛋白浓度 应用分光光度计测定并计算每管蛋白的吸光度，制作出标准曲线。吸取3 μl待测蛋白液，加入100 μl考马斯亮蓝显色液，用分光光度计测定并计算出吸光度值，计算出待测蛋白的浓度。

1.7转膜及染色 电泳分离蛋白分子，转膜，将膜放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。加一抗，4℃摇床过夜。加二抗，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行t检验、方差分析。GraphPAD Prism5.0软件对实验数据作图。

2 结 果

P.g LPS刺激组IRAK-1蛋白水平(1.16±0.12)显著高于阴性对照组(0.73±0.89，P<0.05)。miR-146a-5p转染组IRAK-1蛋白水平(0.52±0.32)显著低于阴性对照组(P<0.05)。miR-146a-5p转染组ABCG1蛋白水平(0.47±0.05)与阴性对照组相比未见明显变化(P>0.05)。miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组IRAK-1蛋白水平(0.66±0.04)显著低于P.gLPS刺激组(P<0.01)。P.gLPS刺激组ABCG1蛋白水平(0.67±0.03)显著高于阴性对照组(0.51±0.12，P<0.05)。miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组ABCG1蛋白水平(0.43±0.02)显著低于P.g LPS刺激组(P<0.01)。见图1。

1～4：阴性对照组、miR-146a-5p转染组、P.g LPS刺激组、miR-146a-5p转染+P.gLPS刺激组图1 miR-146a-5p拮抗P.gLPS诱导的HepG2细胞IRAK-1、ABCG1上调

3 讨 论

T2DM作为一种机体慢性炎症反应，以胰岛素抵抗、血糖水平升高、脂代谢紊乱为主要特征，目前研究显示T2DM患者机体炎性因子如：LPS、肿瘤坏死因子-α水平显著升高，并且升高的炎性因子及其下游级联的炎性反应将会降低机体胰岛素敏感性〔8，9〕。当敲除大鼠炎症因子Toll样受体(TLR)-4基因后，能够增加大鼠肝脏胰岛素敏感性，降低炎性反应，改善肝脏脂肪变性〔10〕。说明降低机体慢性炎症反应将有利于恢复机体对胰岛素的敏感性及有利于机体脂质代谢。

miR-146a-5p作为具有免疫调节功能的miRNA，研究显示其具有促进炎症修复，抑制慢性炎症反应的作用〔11，12〕。研究证实miR-146a-5p在T2DM患者外周血单个核细胞中及T2DM大血管并发症患者血浆中表达均显著降低〔6，7〕。并且在T2DM合并脑卒中患者中检测到血小板和血浆miR-146a-5p水平明显下调，这种下调可能级联诱导血小板激活，在中国T2DM患者中miR-146a-5p表达水平降低是缺血性脑卒中的危险因素〔13〕。本研究结果说明在细胞炎性反应时miR-146a-5p通过下调IRAK-1发挥抑制炎症、防止炎症反应放大的作用。miR-146a-5p具有调节炎症反应的功能，抑制IRAK-1表达是其发挥抑制炎症反应的作用途径之一。如：应用LPS诱导肺泡巨噬细胞产生炎症反应，检测到炎性细胞因子白细胞介素-6、白细胞介素-1β等炎症因子表达水平均升高，予以miR-146a-5p干预后其通过显著下调IRAK-1发挥抑制炎性因子表达的作用〔14〕，还有研究发现炎症因子刺激可诱导MIN6细胞和人类胰岛细胞miR-146a表达水平升高，miR-146a进一步通过下调IRAK-1发挥抑制炎症作用〔15〕，本研究结果证实miR-146a-5p在调整细胞炎症反应等病理生理过程中发挥重要作用。

ABCG1在胆固醇逆转运的初始阶段发挥促进细胞内游离胆固醇外流的作用，起到清除组织细胞内多余胆固醇的作用〔16，17〕。LPS可以诱导腹膜巨噬细胞产生炎症反应，并抑制目标基因ABCG1的表达〔18，19〕。LPS炎性刺激小鼠BV-2小胶质细胞，显著下调ABCG1 转录水平和蛋白水平的表达〔20〕。本研究结果说明在细胞炎性反应时miR-146a-5p能够显著下调HepG2细胞ABCG1蛋白水平。研究显示，许多miRNA可以通过上调或下调ABCG1表达水平参与机体胆固醇代谢〔21〕，本研究显示miR-146a-5p能够负向调节致炎因子P.gLPS介导的胆固醇代谢过程。

综上，miR-146a-5p具有抑制炎症因子及调节脂质代谢的功能，为进一步研究慢性炎症所引起的病理及生理变化奠定基础。