miR-7977对糖尿病患者单核巨噬细胞极化的影响及其机制

张潮 杨巍 (北华大学医学技术学院临床免疫学教研室，吉林 吉林 132013)

2型糖尿病(T2DM)是一种慢性炎症性疾病，其发生与巨噬细胞极化失衡(M1/M2失衡)有关〔1～3〕。miR-7977是一种与炎症相关的微小RNA〔4，5〕，且在T2DM患者外周血中高表达，但目前尚不清楚miR-7977在T2DM发展过程中有何生物学作用。本文旨在探讨miR-7977对单核巨噬细胞极化的影响及相关机制，为T2DM治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1血液标本 随机选取北华大学附属医院2018年1月至2019年12月确诊的T2DM患者40例〔男23例，女17例；年龄(50.23±6.35)岁〕和同年龄段健康体检者40例(男女各20例)作为受检对象。于清晨空腹情况下留取受检者肘静脉血，肝素抗凝。

1.2主要试剂 Ficoll人淋巴细胞分离液、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白浓度检测试剂盒及实验所需引物均由北京鼎国生物技术公司提供。Hsa-miR-7977 inhibitor和negative control由上海吉玛制药技术有限公司合成。兔抗人多克隆神经纤维瘤蛋白(NF)2抗体购自武汉艾美捷科技公司。PE标记的兔抗人CD68抗体和APC标记的兔抗人CD206抗体购自上海凯博生物科技有限公司。逆转录定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自天根生物技术有限公司。MicroChemi化学发光凝胶成像仪为以色列DNR公司产品，ABI prism7000荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品。图像分析采用ImagJ软件。

1.3人外周血单核细胞的提取 将采集的外周血离心洗涤后加等体积磷酸盐缓冲液(PBS)稀释2倍，并缓慢滴加在淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心30 min，吸取白色细胞层置于新的培养皿内，置于37℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h，待细胞贴壁后去掉悬浮的淋巴细胞，即获得单核细胞。

1.4qRT-PCR 采用Trizol法提取细胞总RNA，Nano-Drop 2000微量分光光度计进行RNA定量。按试剂盒说明逆转录为cDNA，进行qPCR检测。反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸10 s，共40个循环；4℃保存。应用凝胶成像系统摄影，Quantity One软件进行扫描分析，采用2-ΔΔCt法计算。实验所用引物序列如下：GAPDH：上游5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游5′-ACTCCACGACATACTCAGC-3′；miR-7977：上游5′-TTCCCAGCCAACGCACC-3′，下游5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3′；NF2：上游5′-ACCGTTGCCTCCTGACATAC-3′，下游5′-GGCCTCGATTTCTGTCTTGA-3′；白细胞介素(IL)-4：上游5′-GTCTCACCTCCCAACTGCTT-3′，下游5′-CTTGGAGGCAGCAAAGATGT-3′；转化生长因子(TGF)-β：上游5′-CAATTCCTGGCGATACCTCAG-3′，下游5′-GCACA ACTCCGGTGACATCAA-3′；肿瘤坏死因子(TNF)-α：上游5′-GCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3′，下游5′-ATGATCTGAGTGTGAGGGTCTGG-3′；iNOS：上游5′-GAGCTTCTACCTCAAGCTATC-3′，下游5′-CCTGATGTTGCCATTGTTGGT-3′。

1.5细胞培养、转染及干预 将T2DM患者外周血单核细胞培养后调整浓度至1×105个/ml，接种于12孔培养板中，每孔1 ml细胞悬液，继续培养24 h。利用 Lipofectamine2000将miR-7977 inhibitor和阴性control分别转染到单核细胞中，转染24 h后将转染液更换为正常细胞培养液继续培养。用0.1 mg/L的脂多糖(LPS)诱导单核细胞向巨噬细胞转化。细胞分成4组，即细胞对照组(单核细胞)、LPS刺激组(单核细胞+0.1 mg/L LPS)、miR-7977抑制组(100 ng/μl miR-7977 inhibitor+单核细胞+0.1 mg/L LPS)和阴性对照组(100 ng/μl miR-7977阴性control+单核细胞+ 0.1 mg/L LPS)。

1.6流式细胞术检测细胞M1、M2表型 将不同处理组的细胞分别用冰预冷的PBS洗涤3次，调整细胞浓度为1×106个/ml后再分成2管，分别加入PE抗人CD68抗体和APC抗人CD206抗体，4℃避光孵育30 min，再经PBS洗涤重悬后用流式细胞仪检测M1、M2表型。

1.7Western印迹 取各组细胞1×106个，放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解后用BCA法测定蛋白浓度，变性离心后取上清进行蛋白上样。按照Western印迹实验流程，依次进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影的操作步骤。以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相对表达量，检测NF2蛋白的表达。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1miR-7977在外周血单核细胞中的表达 miR-7977在T2DM患者外周血单核细胞中的表达(3.07±0.16)明显高于健康对照组(0.99±0.14，P<0.01)。

2.2转染前后单核细胞中miR-7977的表达 miR-7977 抑制组细胞中miR-7977的表达(0.89±0.10)较细胞对照组(3.07±0.16)明显降低(P<0.01)。而阴性对照组(3.05±0.13)和细胞对照组miR-7977表达无明显差异(P>0.05)。

2.3抑制miR-7977的表达对M1/M2表型的影响 细胞对照组M1型细胞比例和M1/M2比值明显低于LPS刺激组(P<0.05)。miR-7977抑制组M1型细胞比例和M1/M2比值明显低于LPS刺激组，M2型细胞比例明显高于LPS刺激组(P<0.05)。阴性对照组的M1型和M2型细胞比例以及M1/M2比值与LPS刺激组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组M1/M2表型比例

2.4抑制miR-7977表达对相关细胞因子mRNA表达的影响 miR-7977抑制组IL-4和TGF-β的mRNA表达与LPS刺激组比较明显升高(P<0.05)；而TNF-α和iNOS的mRNA表达较LPS刺激组明显降低(P<0.05)。阴性对照组和LPS刺激组的四种细胞因子的mRNA表达无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组相关细胞因子mRNA表达

2.5干扰miR-7977对NF2表达的影响 miR-7977抑制组NF2的mRNA和蛋白相对表达量较LPS刺激组和阴性对照组均明显升高(P<0.05)。见图1、表3。

图1 各组NF2蛋白表达

表3 各组NF2 mRNA及蛋白表达

3 讨 论

单核-巨噬细胞系统是固有免疫的重要组成，不同病理生理环境下，单核细胞可向M1型或M2型巨噬细胞转化〔6〕。M1 型巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6、iNOS等促炎性细胞因子，启动和维持炎症反应；M2 型巨噬细胞分泌TGF-β、IL-4等细胞因子，与抗炎反应有关〔7～9〕。T2DM时，胰岛细胞周围浸润着大量极化异常的巨噬细胞，这些巨噬细胞分泌的炎症分子进一步加重胰岛β 细胞的损伤〔10〕。本研究结果提示抑制miR-7977表达可以干扰LPS引起的单核细胞M1型极化；降低miR-7977表达可以抑制LPS引起的M1型细胞因子的表达，同时促进M2型细胞因子的表达；降低miR-7977表达可以抑制LPS诱导的单核细胞M1型极化，降低M1型细胞因子的表达。

Hippo通路是真核细胞中参与增殖分化的信号传导通路，研究发现其在天然免疫和炎症反应中也发挥重要的调节作用〔11〕。Hippo信号通路关闭时，巨噬细胞向M1型极化；Hippo信号通路活化时，巨噬细胞则向M2型极化〔12〕。NF2是Hippo通路的上游调节因子，NF2功能丧失时，Hippo通路信号失活；NF2活性正常或升高时则激活Hippo信号传导〔13〕。本研究结果说明miR-7977可以直接影响NF2的表达，进而影响Hippo通路的信号传导。这一结果与Yoshida等〔14〕的研究结果相一致。

综上，T2DM患者外周血单核细胞中的miR-7977通过抑制NF2基因表达，干扰Hippo信号通路的传导，进而调节单核细胞向M1型极化，加重胰岛细胞外环境的炎症状态。而降低miR-7977表达则可以上调NF2的表达，从而抑制单核细胞向M1型巨噬细胞极化。降低单核细胞M1型极化水平已经被证实是调节T2DM炎症状态的有效方式之一。本研究结果为T2DM的抗炎治疗提供了新靶点。