鼻咽癌患者循环肿瘤细胞ERCC1基因表达与放化疗疗效及预后的相关性

王伟锋 张卓 李云冬 顾安琪 于亚捷 蔡奕铮 邓晓聪

(海南省肿瘤医院 1放疗科一区，海南 海口 570300；2头颈外一科)

鼻咽癌是临床常见的恶性肿瘤，在以鼻咽癌为代表的头颈鳞状细胞癌(HNSCC)中，顺铂联合放疗是局部晚期头颈癌的基础治疗方案之一，但该方案的毒性反应较大，且部分患者出现耐药或放疗抗拒而疗效难尽人意；临床迫切需要特异性靶标来预测放疗抗拒或顺铂治疗的耐药性，从而优化治疗方案，降低毒性反应，提高治疗效果。由于铂类药物的作用靶点是DNA，故DNA 修复能力的不同将直接导致个体间肿瘤细胞对铂类药物敏感性的差异〔1〕；DNA切除修复交叉互补基因(ERCC)1基因定位于染色19q13.2-13.3，作为核苷酸切除修复途径系统的关键基因，其与DNA修复系统密切相关〔2〕。ERCC1参与铂类耐药及放疗抗拒的发生；肿瘤组织中ERCC1表达量增高，铂类联合放疗的PFS更差〔3，4〕，ERCC1的表达量与肿瘤的放射抗拒关系密切。随着循环肿瘤细胞检测技术应用于临床，对于头颈部肿瘤患者可以通过检测外周血循环肿瘤细胞(CTC)获取ERCC1基因表达情况，从而及时调整治疗方案，以期获得更好的疗效，本研究利用成熟的CTC检测技术，通过检测鼻咽癌患者CTC细胞ERCC1基因表达情况，预测疗效并在治疗后随访评估其表达程度与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1患者一般资料 海南省肿瘤医院2018年2～12月就诊的鼻咽癌初治患者42例，男37例，女5例，年龄18～70岁；中位年龄为46岁；均经过鼻咽镜活检确诊，临床分期中Ⅱ期5例、Ⅲ期25例、Ⅳ期12例。患者均进行影像学检查〔鼻咽部及颈部磁共振成像(MRI)+增强，鼻咽部及颈部CT+增强；胸部CT，上腹部彩超，全身骨扫描，脑部MRI或全身单光子发射计算机断层成像术(SPECT)/CT〕；入院时采血行血常规、生化、肿瘤标志物等血液学检查。纳入标准：(1)患者均行鼻咽部活检病理明确为鼻咽癌，患者影像学未发现远处转移，临床TNM分期：Ⅱ～Ⅳ期；(2)美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分≤2分；(3)白细胞计数≥4×109/L，血红蛋白≥90 g/L，血小板≥100×109/L；(4)谷丙转氨酶、谷草转氨酶小于1.5倍的正常值上限，肌酐清除率≥60 ml/min。排除标准：(1)既往有恶性肿瘤病史或本次诊断为双原发肿瘤；(2)之前接受过放疗、化疗或手术等其他抗肿瘤治疗；(3)孕妇或哺乳期妇女；(4)原发灶或淋巴结行手术治疗(活检除外)。

1.2CTC分离及ERCC1基因检测 患者均在开始治疗前采血行CTC检测并检测ERCC1基因的表达情况，并作为基线特征记录；患者在完成诱导化疗后即放疗前进行第2次采血行CTC检测，在完成全部放疗后进行第3次采血行CTC检测。患者血样采集后送由深圳益善生物技术股份有限公司进行检测，CTC检测利用CanPatrolTM二代CTC检测技术，运用纳米技术分离CTC，实现单细胞CTC和成团的细胞微团(CTM)的分离、鉴定和分型。先用免疫磁珠负向去除5 ml外周血中白细胞，然后通过纳米膜过滤检出CTC。CTC细胞分离后采用纳米技术全面分离所有类型CTCs，其中CTC富集效率≥80%。每个CTC细胞利用荧光原位杂交(FISH)分型，采用多重mRNA原位分析技术用来标记ERCC1基因。

1.3化疗 患者均按照2017年鼻咽癌国际临床靶区勾画指南〔5〕推荐治疗方案，行诱导化疗后并接受放化疗同步治疗。诱导化疗期间，TP方案如下：多西紫杉醇(多西他赛，0.5 ml/20 mg；深圳万乐药业生产)75 mg/m2，静脉滴注，d1；顺铂(10 mg/支；山东罗欣药业生产) 100 mg/m2，静脉滴注，d1；21 d为1个周期；化疗前均予以水化等预处理，诱导化疗周期数视患者肿瘤退缩情况及患者耐受情况决定，总疗程不超过3个周期，一般不少于2个周期。同步治疗方案：顺铂100 mg/m2，21 d为1个周期。患者治疗前均需完成规定的影像学检查明确临床分期；患者完成诱导化疗后进行择期根治性放疗，患者放疗时同步顺铂每3 w一次化疗(80～100 mg/m2)，至放疗结束，对于完成全部治疗后仍有肿瘤残留者，予以口服卡培他滨(0.5 g×12片，罗氏制药)1.00～1.25 g/m2连续口服14 d，21 d为1个周期；服用3个周期。

1.4放射治疗 患者均采用头颈肩热记忆膜固定，均使用调强放疗，6 MV X射线并视情况加用电子线治疗，进行靶区勾画。放疗计划的剂量为：原发灶的大体肿瘤靶区(GTV)剂量66.0～71.4 Gy/(30～33次)，颈部转移淋巴结GTVnd剂量采用66.0 Gy/(30～32次)。高、低危临床靶区(CTV)剂量分别为60.0 Gy/(30～32次)和54.0 Gy/(30～32次)。对于新辅助化疗降期患者，以化疗前病灶影像勾画GTV、GTVnd和CTVnd包膜无受侵者按新辅助化疗后实际退缩情况的影像勾画。包膜受侵者按化疗后的影像勾画，同时包括化疗前影像显示的外侵区域。对于鼻腔内肿瘤突出部分，按化疗后实际退缩情况勾画靶区。完成放疗计划处方剂量后，对于淋巴引流区仍残留的肿大淋巴结，根据影像学所见淋巴结大小、深度选择合适能量的电子线单野推量照射，尽量达到消除肿大淋巴结的剂量，最高剂量80 Gy。正常组织剂量限制及处方剂量要求参见放射治疗器官限量国际指南〔6〕相关剂量限制标准。

1.5疗效评价及随访 于2018年3月2日第1例患者完成全部治疗后随访至2020年12月31日。所有患者治疗后随访满2年，最长34个月，中位随访时间19个月。所有患者治疗结束后第1～3年每3个月复查1次鼻咽及颈部CT/MRI、淋巴引流区彩超并体检协助、胸部及上腹部CT，必要时行间接鼻咽镜检查，了解有无局部复发及常见部位远处转移；随访结果详细记录并统计患者2年总生存率(OS)，2年无进展生存(DFS)和局部无复发生存(LRFS)，分析不同阶段CTC中ERCC1基因不同表达强度〔ERCC1表达阳性率≥75%为高表达(H-ERCC1)组；ERCC1表达阳性率≥25%且<75%为中表达(M-ERCC1)组；ERCC1表达阳性率<25%为低表达(L-ERCC1)组。在分析ERCC1基因表达强度对生存的影响时，为了便于统计学分析，治疗的不同阶段不表达患者全部按低表达计〕对患者预后的影响。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。临床分类资料采用相对数描述，随访生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。OS、DFS和LRFS情况的组间比较采用Log-rank检验。

2 结 果

2.1CTC细胞及ERCC1基因表达情况 诱导化疗前不同临床分期患者ERCC1表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。放疗前及放化疗后不同临床分期、诱导化疗周期数患者ERCC1表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特征患者CTC中ERCC1阳性率比较〔n(%)〕

2.2疗效分析

2.2.1近期疗效 所有患者完成标准方案的放化疗；28例(66.7%)出现Ⅲ度放射性口腔黏膜炎，14例(33.3%)出现Ⅱ度放射性口腔黏膜炎；26例(61.9%)患者出现Ⅲ度骨髓抑制；38例(90.6%)患者按期完成拟定的放疗计划，4例(9.5%)患者因放化疗相关反应较严重，延迟1 w完成放疗计划；完成放疗后1个月评估CR者达90.6%(38/42)，4例(9.5%)患者完成放疗后颈部肿块仍残留，完成放疗后继续服用卡培他滨维持治疗3个月后，再次复查，颈部残留肿块完全消失；治疗前合并颅神经症状者共计9例(21.4%)，完成放疗后全部症状缓解(100.0%)。

2.2.2远期疗效 1年和2年生存率分别为97.1%、91.4%(图1)；随访时间内，死亡患者不足一半，中位生存期尚未成熟；1年DFS和LRFS均为100.0%，2年DFS为100.0%，2年LRFS为92.2%。

图1 全部患者总体生存曲线

2.2.3CTC ERCC1表达量对患者生存的影响 诱导化疗前，H-ERCC1组、M-ERCC1组、L-ERCC1组1年OS均为100.0%，2年OS分别为：95.2%、97.6%、100.0%，两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)；ERCC1表达强度并不影响患者生存。放疗前H-ERCC1组、M-ERCC1组、L-ERCC1组1年OS均为100.0%，2年OS分别为：90.4%、92.8%、100.0%，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)；结果提示：经诱导化疗后，ERCC1基因不同表达强度明显影响患者生存，低表达或不表达者预后最好；中表达次之，而高表达者预后最差。放化疗后，H-ERCC1组、M-ERCC1组、L-ERCC1组1年OS均为：85.7%、90.5%、100.0%，2年OS分别为：80.9%、85.7%、100.0%。高表达者分别与低表达和中表达者比较差异均有统计学意义(P<0.05)；而低表达和中表达者生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)；结果提示：在完成标准的放化疗治疗后，ERCC1仍有高表达者预后最差，低表达或不表达者及中度表达者不影响患者预后。见图2。

图2 诱导化疗前ERCC1不同表达强度患者生存曲线

3 讨 论

鼻咽癌为华南地区最为常见的肿瘤之一；局部晚期鼻咽癌患者占初治鼻咽癌比例较高，其易局部浸润、常伴有颈部淋巴结转移，且远处转移率较高等特点使其疗效仍难令人满意，局部晚期鼻咽癌患者的治疗仍没有明显突破，临床预后仍较差，目前基于影像学诊断的肿瘤TNM分期难以发现及提示早期的微转移灶；对肿瘤患者进行预后评估是目前CTC临床应用最广泛的领域，恶性肿瘤患者治疗前后的CTC类型和数目的变化具有重要的预后提示价值。实验证明CTC的出现与晚期癌症患者的预后密切相关〔5〕，CTC检测可随时获取用于评估患者的预后。此外，CTC是游离于患者血液中的肿瘤细胞，携带了肿瘤的全部基因，可以作为基因检测的样本，通过对获取的CTC进行基因分析，能实时反映肿瘤的基因状况，清楚地指导患者下一步的药物选择，提高治疗效果。局部晚期鼻咽癌患者所占新诊断鼻咽癌患者约75%，以铂类为基础的诱导化疗及铂类同步放化疗已成为局部晚期患者的标准治疗方式〔6〕；在以铂类为基础的化疗治疗的肿瘤类型中，ERCC1的表达是肿瘤对顺铂耐药的关键因素；研究表明〔7,8〕，ERCC1不仅参与肿瘤细胞的耐药过程，还参与细胞的生长、凋亡的过程。谢玲等〔9〕研究发现，石蜡标本ERCC1基因的表达量明显高于外周静脉中ERCC1基因的表达，且两者呈正相关，通过外周血检测ERCCl基因的表达一样可以用来研究与癌症患者临床特征及放化疗疗效的关系。

本研究中局部晚期患者占大部分，提示合适强度的诱导化疗有助于降低ERCC1的阳性表达率而改善患者的预后，这一结论在后期随访的结果可以印证。诱导化疗后以顺铂为基础的同步放化疗是局部晚期鼻咽癌的标准治疗方案；经过诱导化疗及同步放化疗后，治疗前的不同CTC ERCC1阳性表达率的患者生存无差异；提示局部晚期患者CTC中ERCC1水平表达并不能判断预后；但是，经过合适的诱导化疗后的患者，ERCC1低阳性表达率患者预后最好。ERCC1的表达与多种肿瘤的放射抗拒相关，其基础理论认为：ERCC1过表达可使停滞在G2/M期的损伤DNA得到迅速修复，而停滞在G2/M期的细胞为放疗敏感期〔10〕；这一点在本研究也得到证实，随访结果提示：放疗前高表达的ERCC1阳性率同步放化疗后预后最差；所有患者在完成全部治疗后，仍有6例患者CTC中ERCC1高表达而预后最差；此外，中度表达、低表达或不表达者预后无统计学差异，综合本研究随访结果分析，鼻咽癌患者CTC中ERCC1的表达可提示放化疗疗效，而不同疗效影响患者生存。

对于局晚期鼻咽癌高危患者，在标准治疗后，是否需要继续辅助化疗仍争议较大〔11〕，本研究随访结果对此有一定的提示意义，鼻咽癌治疗失败大部分是因为发生了远处转移，而循环肿瘤细胞是引起远处转移的主要因素；在完成标准治疗方案后外周循环肿瘤细胞仍存在并高表达ERCC1的患者；可以认定为远处转移高风险患者，因此，对于这一部分患者，理论上是需要后续辅助化疗以降低远处转移率。结合本研究随访结果认为：在患者全程治疗过程中关键时间点检测CTC的数量及其ERCC1的表达率，可以筛选出远处转移高风险的患者，并可以提示患者治疗的预后，对于此类高危患者应继续辅助化疗以降低远处转移率。但本研究样本量较少，仍需进一步扩大样本量以证实研究结果。