溃疡性结肠炎患者骨质流失的危险因素及与粪便菌群的关系

冉 艳，白 洁 ，李培杰，米 琛 ，厉英超

（1. 西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西西安 710061；2. 陕西省人民医院消化内二科，陕西西安 710068）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一类慢性非特异性的炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn’s disease, CD）两种亚型。近年来，随着工业化及全球化进程，IBD 已成为一种全球性疾病，在中国等许多亚洲国家中的发病率也呈现上升的趋势[1-2]。目前研究发现，IBD 不仅累及消化道，还可影响许多肠外器官或组织，引起脊柱关节病、骨质流失、原发性硬化性胆管炎等多种肠外表现或肠外并发症[3-4]，因此被认为是一种全身性疾病。

骨质流失被认为是IBD 患者中一种十分常见的肠外并发症。根据严重程度可将骨质流失分为骨量减少和骨质疏松[5]，严重骨质疏松的患者容易出现骨折，骨折可能会进一步引起感染、栓塞、褥疮、坠积性肺炎等多种并发症[6]，这不仅严重影响了患者的生活质量，也给家庭和社会带来了巨大的经济压力和医疗负担。但是，目前人们对IBD 患者骨质流失的认识不够充分，对其危害也不够重视，IBD 患者骨质流失的危险因素、发病机制及规范诊治仍缺乏大量循证医学证据。因此，开展IBD 患者骨质流失的危险因素及其与粪便菌群的关系研究非常必要，不仅可以了解IBD 患者骨质流失的流行病学特征，还对探索IBD 患者骨质流失的发病机制和新型治疗意义重大。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2020 年1 月至2020 年6 月就诊于西安交通大学第一附属医院消化内科的UC 患者为研究对象。纳入标准：根据2018 年中华医学会消化病学分会炎症性肠病治疗组确立的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》[7]，纳入符合诊断标准的成年UC 患者。排除标准：①患有CD、肠结核、艾滋病肠病、肠道白塞病、结直肠癌等其他肠道疾病者；②患有心脑血管疾病、支气管哮喘、肝硬化、恶性肿瘤等严重疾病者；③患有其他可引起骨代谢异常的疾病者，如甲状腺功能亢进症、甲状旁腺功能亢进症、慢性肾衰竭等；④静脉或口服使用糖皮质激素者，确诊UC 前已有骨质疏松或骨折者；⑤1 个月以内使用抗生素及益生菌者；⑥孕产妇及近期有生育计划的女性。

1.2 研究流程

1.2.1 问卷调查 由经过专业培训的医务人员对纳入的UC 患者进行问卷调查，以保证数据的准确性。收集患者基本信息及相关临床资料，并采用蒙特利尔分型、改良Truelove &Witts 分型、改良的Mayo 评分来判定UC 患者的病变范围、疾病严重程度及疾病的活动性。

1.2.2 收集相关血清学指标 收集骨代谢及炎症相关指标。骨代谢相关指标包括血钙、血磷、甲状旁腺激素、血清25-羟维生素D，炎症相关指标C 反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）。

1.2.3 骨密度测定 为减少个体间误差，本研究均采用西安交通大学第一附属医院双能X 线骨密度仪（LEXXOS-LX381，法国 DMS），测定患者腰椎（L1-L4）及股骨颈骨密度。依据《中国老年骨质疏松症诊疗指南》[8]，本研究将骨量减少和骨质疏松统称为骨质流失，腰椎和股骨颈任何一个部位的骨密度符合骨量减少/骨质疏松的诊断标准，即诊断为骨质流失。

1.2.4 粪便标本采集 患者排便后，尽快用无菌取样勺挖取量约10g 的新鲜粪便，放入清洁干燥的无菌冻存管内，对标本进行编号，转运至-80 ℃超低温冰箱内冻存，避免标本反复冻融。

1.2.5 粪便菌群DNA 提取、16S rDNA PCR 扩增及产物纯化 取所收集的UC 患者粪便标本，于室温下缓慢解冻、融化，提取粪便标本DNA。以341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 806R（5′-GGA CTACHVGGGTATCTAAT-3′）为引物，对粪便菌群16SrDNA 的V3-V4 高变区进行两次PCR 扩增，使用AMPure XP Beads 对PCR 扩增产物进行纯化，并进行定量。

1.2.6 粪便菌群16S rDNA 高通量测序 对粪便菌群16S rDNA 序列的V3-V4 高变区进行高通量测序分析，使用Omicsmart 数据分析平台进行多样性、物种组成及代谢通路分析。

1.3 统计学方法及测序结果分析

采用SPSS 25.0 软件对相关数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行组间比较；计数资料以例数和百分比表示，采用Fisher 精确检验和非参数检验进行组间比较。使用基迪奥生物Omicsmart 数据分析平台对UC 患者粪便菌群进行多样性、物种组成以及代谢通路分析。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 单因素分析

本研究对比了性别、年龄等基本资料，临床分型、疾病分期等临床资料及血钙、25-羟维生素D 浓度等相关血清学指标在骨量正常组与骨质流失组之间的差异。结果显示：骨量正常组与骨质流失组UC 患者之间性别、年龄、发病年龄、病程、体质量指数均无统计学差异；慢性复发型患者骨质流失的发生率明显高于初发型患者（P=0.047），随疾病严重程度加重，UC患者骨质流失的发生率增加（P=0.016），两组之间疾病分期、病变范围、疾病活动性无统计学差异；骨量正常组患者血钙、25-羟维生素D 浓度明显高于骨质流失组患者（P＜0.05），而两组之间血磷、甲状旁腺激素浓度及CRP、ESR 水平均无统计学差异（表1）。

表1 骨量正常组与骨质流失组相关指标的比较Tab. 1 Differences between the normal group and the bone loss group

2.2 粪便菌群16S rDNA 测序分析结果

2.2.1 多样性分析

2.2.1.1α多样性分析：Shannon 指数和 Simpson 指数可综合体现物种的丰富度和均匀度，常用于反映物种α多样性。从图1 可以看出，骨质流失组的Shannon指数和Simpson 指数均低于骨量正常组，表明骨质流失组粪便菌群的α多样性减低，但经统计学检验，两组之间α多样性的差异无统计学意义（P=0.333）。

图1 骨量正常组与骨质流失组Shannon 指数和Simpson指数条形图Fig.1 Shannon and Simpson indexes of the normal group and the bone loss group

2.2.1.2β多样性分析：β多样性指的是样本间多样性 ，常 用 PCoA、NMDS 来 反 映 。 PCoA 分 析 和NMDS 分析以散点图的形式来展现不同样本和不同分组的分布特征，样本之间的距离越近，表示样本菌群结构的相似程度越大。如图2 所示，同组内样本相互聚集，而不同组间的样本呈现分离趋势，这表明同组内样本的菌群相似程度较大，而两组间样本的菌群差异程度较大，两组之间粪便菌群的β多样性具有统计学差异。

图2 骨量正常组与骨质流失组粪便菌群的PCoA 分析和NMDS 分析Fig. 2 PCoA and NMDS analyses of fecal microbiota in the normal group and the bone loss group

2.2.2 物种组成分析 对骨量正常组和骨质流失组的粪便菌群在不同水平上进行物种组成分析。如图3 所示，在门水平上，骨质流失组粪便菌群中厚壁菌门丰度下降（70.8%vs.49.3%,P=0.001），而变形菌门丰度上升（10.0%vs.31.8%,P=0.044）；在纲水平上，骨质流失组粪便菌群中γ-变形杆菌纲丰度上升（10.0%vs.31.3%,P=0.046）；在目水平上，骨质流失组粪便菌群中肠杆菌目丰度上升（7.4%vs.29.5%,P=0.044）；在科水平上，骨质流失组中肠杆菌科丰度上升（7.4%vs.29.5%,P=0.044），而毛螺菌科（22.0%vs.9.9%,P=0.040）和乳杆菌科（4.9%vs.0.9%,P=0.030）丰度下降；在属水平上，骨质流失组中埃希氏菌属丰度上升（1.9%vs.25.8%,P=0.011），而乳杆菌属丰度下降（4.8%vs.0.8%,P=0.032）；在种水平上，骨量正常组与骨质流失组粪便菌群的物种组成无统计学差异。

图3 不同水平的物种组成堆叠图Fig.3 Stacking diagrams of species composition at different levels

2.2.3 菌群代谢通路分析 骨量正常组与骨质流失组之间菌群代谢通路具有明显差异。经过与KEGG 数据库比对，骨质流失组在志贺菌、香叶醇的降解、类固醇激素的合成、细菌侵袭上皮细胞及青霉素和头孢菌素的生物合成等信号通路上的功能丰度明显上升。

3 讨 论

骨质流失在UC 患者中具有较高的发生率，这与既往大多数研究的结论一致[9-11]。UC 患者出现骨质流失的风险明显高于普通人群，这提示需要特别关注UC 患者的骨骼健康问题。许多研究表明，女性较男性更易出现骨质流失，尤其是绝经后女性，这可能与雌激素等多种因素有关[12-13]。本研究中男性UC 患者骨质流失的发生率高于女性（73.3%vs.44.4%），但二者间的差异无统计学意义。本研究排除了合并有心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病的患者，而这些多为增龄性疾病。因此，本研究纳入的患者多为青中年人[所有患者的平均年龄为（39.1±12.5）岁]，这些年龄范围内的女性患者尚未进入围绝经期，雌激素对女性具有明显的保护作用。因此，本研究中女性患者骨质流失的发生率较男性患者低。

慢性复发型、活动期、病变范围较广、严重程度较重的UC 患者发生骨质流失的风险会有所增加，这可能与慢性病程、活动期炎症重、肠黏膜对营养物质的吸收严重减少等原因有关[14-15]。本研究发现，UC 患者骨质流失的发生率与临床分型及疾病严重程度有关，但未发现与疾病分期、病变范围、疾病活动性有明显关联。

骨质流失组UC 患者血钙和25-羟维生素D 浓度较骨量正常组明显减低，这与许多研究的结论一致，表明了钙和维生素D 对骨骼健康的重要性。但也有研究表明，补充钙和维生素D 无法降低骨折的发生率，钙和维生素D 与IBD 患者骨密度之间缺乏明确的相关性[16-17]。目前有关钙和维生素D 能否降低骨质疏松及骨折风险仍存在一定争议，仍需进行更深入的研究。本研究仅收集了基线水平时的骨代谢指标及骨密度数据，未对患者进行干预及治疗后随访，未来可在补充钙和维生素D 后复查骨代谢指标和骨密度，以明确补充钙和维生素D 能否改善UC 患者的骨密度。

本研究未发现CRP、ESR 与UC 患者骨质流失具有明显关联。CRP 和ESR 均为非特异性炎症指标，因而它们在评估IBD 患者炎症活动性中的价值比较有限[18]。除 CRP、ESR 之外，TNF-α、IL-6 等炎症细胞因子的水平也可反映IBD 患者的炎症活动性。TNF-α 等细胞因子与IBD、类风湿关节炎等疾病的发生有关。有研究表明，使用英夫利西单抗有利于改善IBD 患者、类风湿关节炎患者的骨质流失[19-20]，这不仅从侧面反映了炎症细胞因子在骨质流失中的致病作用，也表明抗TNF-α 制剂可以作为一种抗骨质流失的有效手段。进一步可以测定血清中TNF-α、IL-6 等炎症细胞因子的水平，研究其与UC 患者骨质流失间的相关性，为预测UC 患者骨质流失的风险以及作为一种有效治疗靶点提供可靠的依据。

骨质流失组粪便菌群的α 多样性减低，但两组间差异无统计学意义。两组之间β 多样性存在统计学差异，且物种组成在门、纲、目、科、属水平上均具有统计学差异。与骨量正常UC 患者相比，骨质流失UC患者粪便菌群多样性减低更明显，且菌群失调更严重。本研究表明，肠道菌群的组成及功能与骨质流失的发生发展密切相关，这与许多动物实验及人群研究的结论一致[21-26]。研究发现，与健康人群相比，骨质疏松患者的肠道菌群丰富度和多样性降低，且肠道菌群在门和属水平上的物种组成均存在明显差异[21,25]。动物实验还发现，补充鼠李糖乳杆菌等益生菌可明显改善小鼠的骨质流失[27]，这表明益生菌可能对骨质流失具有一定的治疗作用。因此，可以推测，乳杆菌等益生菌减少可能对UC 患者的骨质流失具有致病作用，而补充益生菌可能对UC 患者骨质流失具有治疗作用。

相关宏基因组学研究发现，肠道菌群是通过代谢和免疫途径参与了骨质疏松的发生发展过程[24,26]。本研究发现，两组患者肠道菌群的许多代谢通路都存在明显差异，骨质流失UC 患者中志贺菌、香叶醇的降解、类固醇激素的合成等通路表达丰度明显升高。志贺菌代谢通路的差异进一步表明了粪便菌群在UC 患者骨质流失中的重要作用。同时，具有抗炎、抗氧化等多种药理作用的香叶醇有望通过改善肠道炎症、减轻免疫炎症反应[28-30]，从而改善骨质流失。骨质流失是糖皮质激素的常见药物不良反应之一[31]，类固醇激素的合成通路表达丰度升高与其在骨质流失中的致病作用相一致。这些具有明显差异的代谢通路有助于阐明肠道菌群参与骨质流失的病理机制，也有望成为治疗骨质流失的突破口，但目前相关研究依然较少，这些复杂的基因、代谢网络仍有待进一步挖掘，才能对阐明致病机制和开拓新型治疗方法提供严谨可靠的理论依据。

本研究是一项回顾性临床研究，尽管具有样本量较少、未设立健康对照组、未进行干预和随访等局限性，但本研究发现，UC 患者骨质流失与临床分型、疾病严重程度及钙和维生素D 浓度有关，同时也发现其与粪便菌群密切相关，这为探索UC 患者骨质流失的发病机制和开拓新型治疗方法提供了新思路。根据初步探索得到的研究结论，我们可以进一步扩大样本量，设立健康对照组，对患者进行干预及随访，还可以对有望用于防治骨质流失的药物（如益生菌、香叶醇等）进行疗效及安全性评估，并对药物组成、给药剂量和治疗疗程进行优化，为UC 患者骨质流失的治疗提供更多的可能性。