加味芩桂术汤联合奥氮平对糖尿病大鼠P38-MAPK信号通路介导的心肌纤维化影响

蔡素华，任礼锡 (广州中医药大学金沙洲医院药学部，广东 广州 510168)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病重要并发症之一，同时也是造成糖尿病死亡的主要原因[1]。DCM的典型病理变化主要是心肌纤维化及心肌肥厚等，心肌病变的发生主要同糖尿病高血糖、高血脂状态相关，可引起氧化应激及相关线粒体功能障碍[2]。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)属于一种可被细胞因子、神经递质、激素等不同的细胞外刺激等激活的促分裂原活化蛋白激酶，可起到应激调节及促炎性反应的作用。加味芩桂术汤具有活血宁心、健脾利湿、温阳化饮的功效，现代医学研究表明其中的黄芪可改善T细胞功能及降低肺动脉压，减轻右前心负荷及松弛血管平滑肌，增加血流量[3]。奥氮平是非典型神经安定药，能够拮抗多巴胺、5-羟色胺(5-HT)及胆碱能受体。然而关于加味芩桂术汤联合奥氮平对于调节糖尿病大鼠P38-MAPK信号通路所介导的心肌纤维化的作用机制尚且不明确[4]。基于此，本研究拟建立糖尿病大鼠模型，探讨了联合用药的干预机制。

1 资料与方法

1.1材料：选取70只清洁级雄性SD大鼠，平均体重(204.15±8.42)g。大鼠均自由觅食饮水，在20℃～25℃温度及50%～55%湿度的环境下进行适应性喂养，持续喂养1周后开始实验。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2试剂：奥氮平(江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20010799，规格10 mg*7 s)；链脲佐菌素(Sigma公司)；兔抗鼠P38-MAPK抗体(北京博奥森公司)。

1.3方法

1.3.1造模：按30 mg/kg体重的剂量腹腔内注射链脲佐菌素，5 d后检测血糖指标不达标者再按25 mg/kg体重的剂量腹腔内注射链脲佐菌素。造模成功的标准为最后1次注射5 d后测定尾静脉随机血糖，认为血糖≥16.7 mmol/L者为造模成功。

1.3.2分组：最终40只大鼠建模成功，然后按照随机数字表法分成模型组、加味芩桂术甘汤组、奥氮平组、加味芩桂术甘汤联合奥氮平组，每组各10只大鼠。其余的30只未建模成功的大鼠纳入为对照组。模型组与对照组均给予0.9% NaCl溶液5 ml/(kg·d)，奥氮平组给予10 mg/d灌注。加味芩桂术甘汤组给予加味芩桂术甘汤，基础组方如下：甘草6 g、酒军8 g、麻黄8 g、桔梗 10 g、陈皮10 g、大腹皮10 g、川芎10 g、丹参30 g、黄芪30 g、茯苓30 g、葶苈子15 g、白术15 g、桂枝15 g。辨证加减，对紫绀严重者加泽兰20 g；气虚乏力者加人参10 g；腹胀纳差者加厚朴15 g；痰多咯痰不爽者加莱菔子5 g、枳实5 g、半夏5 g。1次/d，连续8周。加味芩桂术甘汤联合奥氮平组同时给予两种药物干预。

1.4观察指标：各组均在喂养8周后处死大鼠，取组织进行病理形态学观察、超声心动图检查及P38-MAPK蛋白表达。①病理形态学观察:称重左心室重量，取心尖部分置于4%多聚甲醛固定48 h，固定的心肌组织脱水及石蜡包埋，制作切片后Masson染色、脱水、透明并封片固定，阿光镜下观察心肌细胞及胶原形态，采取计算机软件定量分析心肌胶原含量。②超声心动图检查:实验末进行超声心动图检查，清晰显示胸骨旁长轴切面，测量舒张末期左室内径、右室内径、收缩末期左房内径及左室射血分数。③应用Western印迹检测P38-MAPK蛋白表达情况，主要取各组小鼠左心室心肌组织提取蛋白，经增强化学发光法显色及曝光后扫描，利用Image J图像分析软件做光密度分析，经β-actin为内参。

1.5统计学方法：所有数据用统计软件SPSS19.0进行分析。计量资料不同组间参数的比较采用方差分析，对有差异结果进一步采用q检验进行两两比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1病理形态学观察：经Masson染色，光镜下显示对照组大鼠细胞核呈深蓝色，胶原纤维染成蓝绿色，少量均匀分布，心肌细胞染成红色。模型组大鼠心肌细胞间质胶原纤维表达增加、排列紊乱及分布不均；加味芩桂术甘汤组、奥氮平组、加味芩桂术甘汤联合奥氮平组心肌胶原分布均匀，胶原表达量减少，具体以联合组表现更为明显。

2.2心脏血流动力学：模型组在舒张末期左/右室内径、收缩末期左房内径上比对照组更高，左室射血分数比对照组更低，而经不同治疗方式的各模型组各指标均改变，其中加味芩桂术甘汤联合奥氮平组变化最为明显，同对照组接近度高。见表1。

表1 各组大鼠心脏血流动力学指标比较

2.3心肌胶原含量、P38-MAPK蛋白表达：各组治疗后心肌胶原含量、P38-MAPK蛋白表达情况见表2，模型组水平最高，各治疗组在指标水平上均较模型组降低，其中以加味芩桂术甘汤联合奥氮平组降低最明显，同对照组一致性高。见表2。

表2 各组大鼠心肌胶原含量、P38-MAPK蛋白表达水平比较

3 讨论

DCM是糖尿病典型病变，病机复杂，目前多数资料显示P38-MAPK信号通路活化是关键机制，P38-MAPK信号通路促进下游转录因子核因子κB活化，启动相关炎性因子转录及表达，引起心肌纤维化，加剧DCM损伤[5-6]。

本研究结果显示，模型组大鼠存在明显P38-MAPK信号通路活化，而奥氮平组、加味芩桂术甘汤组、加味芩桂术甘汤联合奥氮平组经治疗可有效抑制P38-MAPK信号通路活化，这样发挥抗炎及抗心肌纤维化的目的，在大鼠各血流动力学变化上，联合组也更明显，表明加味芩桂术汤联合奥氮平作用突出。主要是加味芩桂术甘汤可起到活血宁心、健脾利湿、温阳化饮的功效，现代药理研究也显示，黄芪能够有效促进慢性肺心病患者的T细胞功能，将患者肺动脉压降低，将其右心前负荷减轻，川芎能够促使血管平滑肌松弛，将肺心血管扩张，增加血流量，将微循环有效改善，将肺动脉高压降低，促使患者的心功能得到有效改善。奥氮平拮抗多巴胺、5-羟色胺(5-HT)及胆碱能受体，通过联合作用可调节大鼠心脏功能，下调P38-MAPK信表达，抑制严重及抗心肌纤维化[7-8]。

综上所述，加味芩桂术甘汤联合奥氮平对糖尿病大鼠的心肌有保护作用，可能机制是下调P38-MAPK蛋白表达，这让以P38-MAPK信号通路为切入点的治疗方式提供理论及实践依据。