CRISPR/Cas9系统在基因编辑猪生产中的应用

于海颖，路永强，张 鲁，刘国世*

（1.中国农业大学，北京 100193；2.北京市畜牧总站，北京 100107）

基因编辑（gene editing or genome editing）是指通过生物技术手段对生物体的特定基因进行精确改造，包括对目的基因进行删除、替换、插入单个核苷酸或某段DNA序列，以达到改变生物遗传信息和性状的目的。自2015年开始，基因编辑领域迎来高速发展时期，广泛应用于畜牧业生产、医药领域、环境保护等方面。目前，基因编辑系统主要有三类，其中包括锌指核酸酶（Zin-finger nuclease，ZFN）、类转录激活因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9。这些基因编辑技术的广泛应用，使动物基因定点修饰技术取得突破性进展。

CRISPR由一个可以“剪开”特定DNA序列的蛋白质和一个可以定位基因的“GPS向导”组成，通过单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA）与靶标互补配对，招募Cas9蛋白对基因组进行切割［1-2］。CRISPR系统最初来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes），即A群链球菌（group A Streptococcus，GAS）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），本是原核生物用来标记和抵御病毒入侵的一种免疫防御机制。作为第三代人工核酸内切酶基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统因高效、便捷、适应范围广泛，具备完全取代ZFN技术和TALEN技术的潜力［3］。自2013年首次将CRISPR/Cas9系统应用于哺乳动物以来，基因编辑动植物在生物学研究、农业育种、医学研究、人源化器官生产和临床疾病治疗等多个领域展现出巨大的应用价值［4-6］。

猪作为一种重要的农业经济动物，在解剖学、生理学、疾病发生机制、基因水平、蛋白质功能乃至机体大小方面均与人类十分相似，是研究人类生命活动基本规律、重大疾病及新药研发的理想模式动物之一［7-8］。同时，随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉的瘦肉率、肌内脂肪、酸碱度和肉色等品质性状的要求逐步提高。为满足市场和人们的需求，基因编辑成为潜在的突破性技术。文章对CRISPR/Cas9系统在猪遗传育种、人类疾病模型建立和异种器官移植等方面进行综述，以期为我国畜牧业健康发展和生物医药研究提供参考。

1 CRISPR/Cas9技术在猪育种中的应用

传统的猪育种手段，如纯系选育和配套杂交，需要耗费大量的人力和物力，培育理想经济性状所需周期长并存在优良性状难以聚合、改良目标性状不确定性较大等问题，极大地限制了猪遗产改良的进展。基因编辑技术能够对猪进行快速定向的遗传改良，短时间内就能获得自然状态下经过长期选育才能获得的表型，弥补了传统育种的不足。2015年，Ruan J.等［9］利用包括CRISPR/Cas9在内的多种基因编辑技术在猪基因组的H11位点插入9.4 kb长的外源DNA片段，证实CRISPR/Cas9系统编辑效率最高，为后续制备高效安全的转基因猪奠定了基础。目前，科学家们将CRISPR/Cas9技术和体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）相结合，实现了特定性状的精准改变，已完全颠覆现有的猪遗传改良路径和品种选育效率，为猪育种提供了全新的思路。

1.1 提高肉品质

我国肉猪地方品种多，普遍具有繁殖力强、肉质好、抗病和适应性强等优点，但是饲料利用率和瘦肉率较低，饲养周期长，饲料报酬低。我国每年都需要从国外进口大量优良品种种猪和精液。国外猪种的特点是体格大、屠宰率和瘦肉率高，因此，很多农户选择饲养外国猪种，而我国地方猪种的群体数量近年来呈显著下降趋势。近年来，研究人员利用CRISPR/Cas9技术对猪的多种生产性能进行分子水平的改良，培育出众多具有优良性状的品种。

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因是目前发现的唯一能够抑制骨骼肌细胞增殖与分化的基因，该基因突变会导致猪肌肉异常增长或产生双肌臀表型［10］。2015 年，Wang K.K.等［11］利用CRISPR/Cas9技术对MSTN基因进行定点编辑，获得肌纤维数目和肌肉生长速率显著增加的基因编辑猪，最终表现出特定的双肌臀表型。在动物上MSTN基因编辑导致的基因失活等同于自然变异，这有利于转基因食用动物商业化获得公众和监管机构的更多支持。解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）是一种在棕色脂肪组织中特异表达的线粒体内膜蛋白，能够参与棕色脂肪的产热调节和能量代谢，以维持机体的能量代谢平衡。在进化过程中现代家猪的祖先在2 000年前丢失该基因，Zheng Q.T.等［12］利用CRISPR/Cas9技术成功实现UCP1基因在猪白色脂肪组织中的特异表达，显著降低了基因编辑猪的脂肪率和背膘厚度，并显著提高了瘦肉率，这不仅有利于新生仔猪抵御寒冷环境，更有助于挽救寒冷地区畜牧业生产的经济损失。猪胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）是胰岛素类激素家族的重要成员之一，广泛参与机体众多生理代谢过程，在肌肉发育和脂肪沉积等方面发挥重要作用，另外也参与动物细胞的增殖、分化等活动［13］。2018年，Xiang G.H.等［14］利用CRISPR/Cas9技术对IGF2内含子3中一个保守的SNP位点进行编辑，得到在体重、胴体率和瘦肉率等方面都显著高于野生型的新品种，首次证明通过编辑基因组非编码区能够显著提高牲畜的生产经济性状，这为精确育种提供了全新的思路和策略。

中国生猪出栏量、消费量均位于世界各国之首，肉猪养殖在中国畜牧业中具有重要地位。因此，建立新的技术策略促进我国本土优良猪种的选育，一直是肉猪养殖领域关注的重点，具有重要的经济价值和社会意义。CRISPR/Cas9技术在短时间内创造了具备优越生产性能的猪群体，在保留我国特有肉猪种系优点的基础上进一步提高其生长率和瘦肉率，不仅具有重要的经济价值，对于保护我国地方品系资源也具有重要意义。

1.2 提高抗病性

作为一个养猪大国，我国不仅养殖方式多样，疫病流行情况也相对复杂，猪病流行给畜牧业带来巨大的经济损失，人畜共患病和食品安全更严重威胁着人类的健康。科研人员逐渐意识到单纯依靠药物和疫苗无法彻底控制猪病，因此，从遗传角度利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术研究培育新的抗病品种成为解决问题的关键。

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproduction and respiratory syndrome，PRRS）俗称“蓝耳病”，会导致母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重的呼吸道疾病。在中国广泛传播的猪高热病是由蓝耳病病毒（Porcine reproduction and respiratory syndrome virus，PRRSV）的高致病性毒株引起的，死亡率在2%～100%之间。清道夫受体CD163蛋白是PRRSV入侵宿主时的重要识别蛋白，能够促进病毒脱壳并将病毒基因组RNA释放到细胞质中发挥作用［15-16］。2013年，Prather团队首次利用基因编辑技术治疗猪传染性疾病，发现CD163的第7外显子双等位基因敲除猪具有很好的抗病能力，为后续研究奠定了重要基础［17-19］。2014年，K.M.Whitworth等［19］通过显微注射Cas9 mRNA和sgRNA获得能够抵抗蓝耳病病毒的CD163双等位基因敲除猪，取得猪育种领域的重大突破。随后的多项研究表明，CD163基因外显子7上富含半胱氨酸的结构域5（scavenger receptor cysteine-rich domain 5，SRCR5）是PRRSV感染所必需的。2018 年，C.Burkard 等［20］利 用CRISPR/Cas9系统敲除猪CD163蛋白的SRCR5结构域，成功制备了能抵抗PRRSV-1的抗病猪。Guo C.H.等［21］进一步特异性删除SRCR5结构域中的部分序列，培育出可抵抗PRRSV-2的长白猪和两广小花猪抗病猪模型。随后，科研人员发现只需对SRCR5结构域进行单个碱基编辑，即可获得抵抗蓝耳病的猪模型［22］。更重要的是，通过此种方法生产的基因编辑猪不导入外源基因且不影响CD163的生物学功能，因此不存在转基因生物安全问题。除了蓝耳病以外，科研人员可以利用相同手段对伪狂犬、口蹄疫、圆环病毒病、流行性腹泻和非洲猪瘟等猪病进行了抗病育种研究，这对于提高猪抗病性具有重要推动作用。

CRISPR/Cas9技术的发展与应用为探究病毒致病机制、新型疫苗研发及抗病毒药物研发等领域提供了强有力的工具。在对疾病发生机制研究的基础上，利用CRISPR/Cas9技术进行有针对性的高效基因编辑，是实现猪抗病育种突破的关键技术手段，对推动畜牧业健康发展具有重要作用。目前，CRISPR/Cas9技术还只是局限在宿主与病毒的相互作用方面，过度依赖于复杂竞争的细胞过程，在一定程度上限制了基因编辑的效率和精准度。

2 CRISPR/Cas9技术在建立人类疾病猪模型上的应用

目前用于人类疾病研究的基因编辑动物模型主要是以小鼠、大鼠为代表的啮齿类动物模型和以猪为代表的大动物模型。与啮齿类动物模型相比，猪的组织和器官在生理学、营养学和遗传学等方面与人类具有更高的相似性，是人类疾病研究领域的理想模型之一。同时，由于胚胎干细胞技术较难、繁殖周期长及基因编辑效率低等，大型哺乳动物模型的构建一直都是技术攻关的难点。目前，利用CRISPR/Cas9技术已获得多种人类疾病的猪模型。

2.1 心血管疾病模型

心血管疾病是全球的头号死因，由于心血管疾病具有高发病率、高致残率、高死亡率等特征，目前已成为严重威胁人类生命健康的常见病、多发病。血管性血友病（von willebrand disease，vWD）是一种常见的遗传性出血性疾病，由常染色体遗传的血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）的数量或结构异常所造成的，以出血倾向、出血时间延长、血小板黏附功能下降等为主要临床特点［23］。2014年，Hai T.等［24］获得vWF双等位基因敲除的小型巴马猪，该突变体的凝血时间显著高于野生型，表现出严重的凝血功能障碍，这是首次利用CRISPR技术制备出具有特定疾病表型的哺乳动物疾病模型。尼曼-匹克C1型类似蛋白1（niemann-pick type C1 like l，NPC1L1）是一种跨膜蛋白，在外源性胆固醇吸收和代谢过程中发挥重要的调节作用［25］。2015年，Wang Y.等［26］利用CRISPR/Cas9技术成功制备NPC1L1敲除猪，为深入研究NPC1L1基因在人类胆固醇吸收中的功能提供了新信息。低密度脂蛋白受体（lowdensity lipoprotein receptor，LDLR）是家族性高胆固醇血症的主要致病因子，该蛋白位于肝细胞表面，在肝脏低密度脂蛋白胆固醇清除中起关键作用［27］。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用，是极低密度脂蛋白和乳糜微粒的重要组成部分［28］。Huang L.等［29］利用CRISPR/Cas9技术成功制备了LDLR和ApoE双基因敲除猪，该种猪血液中低密度脂蛋白、胆固醇、总胆固醇和载脂蛋白B的水平显著升高，成为研究代谢紊乱和动脉粥样硬化疾病的大动物模型。胆固醇的吸收和代谢异常会增加动脉粥样硬化与早发冠心病的风险，这些疾病模型的建立为探究人类心血管疾病的发病机制和治疗方法提供了基础，具有巨大的市场潜力和商业化前景。

2.2 代谢异常疾病模型

肥胖是由于机体长期能量摄入超过消耗而引起能量平衡紊乱，导致机体生理功能出现异常的一种病理状态。肥胖会对机体多个器官产生影响，引起代谢紊乱，诱发2型糖尿病、心血管疾病等慢性病。目前，肥胖和代谢综合征的人数在全世界范围内迅速增长，导致高发病率和死亡率。黑皮质素3受体（melanocortin 3 receptor，MC3R）是位于哺乳动物细胞表面的视紫红质样G蛋白偶联受体，在能量稳态方面发挥一定的调节作用［30］。2019年，Yin Y.J.等［31］利用CRISPR/Cas9技术并结合SCNT技术制备了MC3R敲除猪，该猪的体重和体脂率均显著高于野生型，成为研究人类肥胖疾病的良好非啮齿类动物医学模型。糖尿病作为一种代谢紊乱引起的慢性疾病，目前医学界对糖尿病的治疗广泛使用猪源胰岛素。但由于猪和人的胰岛素蛋白存在一个氨基酸的差异，使用猪源胰岛素效率较低且长期使用易诱发抗体的产生［32-33］。2016年，Yang Y.等［34］利用基因编辑技术对猪胰岛素基因进行定点修饰，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因修饰猪，为糖尿病治疗和临床异种胰岛移植治疗提供了研究基础。目前在研究中已经发现多种与糖尿病等代谢疾病相关的基因，基于CRISPR的基因编辑系统对这些机体代谢相关基因进行干预，将有利于在遗传水平上帮助人类改善肥胖症及相关代谢性疾病。

2.3 神经退行性疾病模型

亨廷顿舞蹈病、阿尔兹海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等均因为蛋白质的错误折叠而导致神经细胞死亡，是当今社会严重威胁人类健康的神经退行性疾病［35］。伴随人年龄的逐渐增长，这些疾病逐渐产生，可遗传，呈渐进性发展，但由于缺乏合适的动物模型进行药物筛选，目前尚无有效治疗方法。2015年，Zhou X.Q.等［36］利用CRISPR/Cas9系统针对猪基因组中PARK2和PINK1基因的外显子区域设计Cas9打靶质粒，成功建立了帕金森综合征医用猪模型，首次实现了大动物的双基因等位敲除。亨廷顿舞蹈病是由单基因（Hunting，HTT）突变导致的神经退行疾病，是研究蛋白质错误折叠引起选择性的神经退行性病变和多基因突变病症的基础［37］。2018年，Yan S.等［38］首次利用CRISPR/Cas9技术精准将人的突变亨廷顿舞蹈病基因精确地插入猪HTT内源性基因中，在国际上首次建立了与神经退行性人突变基因相似的大动物模型。亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中的一个里程碑式的发现，为我国脑科学与类脑研究提供了最新手段，标志着我国大动物模型研究走在了世界前列。更值得关注的是，这些疾病模型的病理特征及异常行为均可稳定遗传给后代，这为开发治疗神经退行性疾病新手段提供了稳定、可靠的动物模型，更能够为制备其他神经退行性疾病大动物模型提供技术范本和理论基础。

3 CRISPR/Cas9技术在生产异种器官上的应用

自20世纪80年代免疫抑制药物应用以来，临床器官移植成为晚期器官功能衰竭的首选治疗手段。目前在全世界范围内器官来源严重短缺的问题尚未解决，异种器官移植和异种细胞移植是解决人供体器官短缺的重要途径。猪的生理和解剖结构与人类高度类似，被认为是人体异种器官来源及异种细胞再生的首选动物。

目前，猪器官植入人体存在的一个最大障碍是超急性排斥反应。非灵长类动物的细胞表面存在一种称为α-1，3半乳糖（α-1，3 galactosidase，αgal）的抗原，在长期自然进化过程中α-gal在灵长类中已经消失，但却存在针对该抗原决定簇的天然抗体。因此，只有培育出完全不含α-1，3-半乳糖转移酶（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因的转基因猪，才能彻底消除这种免疫排斥反应。2014年，M.Sato等［39］利用CRISPR/Cas9系统成功敲除了猪的GGTA1基因，消除了猪和人的异种器官移植排斥问题，为人类器官移植探究提供了良好模型。此外，猪自身携带有内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovirus，PERVs），该病毒对猪不具备毒性，但在体外不仅能感染人细胞，还可在人细胞之间传播，一旦侵入人体可能会引起免疫缺陷、肿瘤发生等健康隐患。因此，作为器官移植的供体必须清除猪体内的所有PERVs。2015年，Yang L.H.等［40］利用CRISPR/Cas9技术在全基因组范围内从PK15猪肾细胞和成纤维细胞中敲除PERV的所有拷贝，成为迄今为止最广泛的CRISPR编辑壮举。2017年，Niu D.等［41］成功在猪原代细胞系中灭活了所有的PERVs，并通过体细胞核移植获得世界首批PERVs灭活猪模型，第一次从根本上解决了异种器官病毒传染的风险，是异种器官移植科学研究进程的标志性里程碑。尽管敲除GGTA1基因后能够逃避超级性免疫排斥反应，但是引起超急性免疫排斥反应的靶点却不只有GGTA1基因，还有胞苷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因、β-1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶（β-1，4-N acetylgalactosaminyl transferase 2，β4GalNT2）基因和去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1）基因等。因此，2020年，Fu R.等［42］成功敲除猪体内的GGTA1、β-微球蛋白（β-microglobulin，β2M）和主要组织相容性复合体Ⅱ类兴奋剂（major histocompatibility complex classⅡtransactivator，CIITA）基因，有效缓解了异种免疫反应并延长了异种发生过程中猪的存活时间。2021年，Yue Y.N.等［43］进一步在PERVs敲除猪体内移除3个激活免疫反应的基因，插入6个移植人体免疫反应的基因和3个调节免疫反应的基因，大大减轻了人体免疫排斥反应。

近日，世界首例基因编辑猪肾脏成功植入人体，成为猪异种器官移植探索的重要里程碑。移植后该器官不仅能正常发挥功能，且短时间内未发生免疫排斥反应。更重要的是，全球首次猪心脏移植人体手术也顺利开展，首次证明基因编辑动物心脏可以在人体内正常工作。这标志着科学家们向利用动物器官拯救人类生命迈出重要一步。

随着基因编辑技术的迅猛发展，各种异种器官移植难题逐渐被克服，利用基因编辑技术改造猪器官并结合克隆动物技术，培育能为人类提供器官的基因修饰猪，将为更多器官功能衰竭晚期病人带来新生。

4 问题与展望

近年来，CRISPR基因编辑技术的多样性、模块性和高效性正在掀起一场生物技术革命。从纯粹的技术角度来看，CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率和准确性都较高，但也存在严重的脱靶问题。由于基因组的复杂性极高，sgRNA可能会与非靶向序列局部配对，激活Cas9内切酶活性发生非特异性切割，从而干扰细胞的正常功能，甚至诱发诸如癌症等多种疾病。目前，主要通过改造Cas9蛋白和优化sgRNA两方面降低脱靶效率。此外，有研究人员还指出，CRISPR技术会造成编辑位点附近出现大量DNA缺失和重排，从而增加基于CRISPR治疗的复杂性［44］。

2018年11月份，我国的一个研究团队秘密将CRISPR/Cas9技术应用于人类胚胎的修饰，在国际上引起轩然大波［45］。CRISPR/Cas9技术能够通过编辑成年动物的胚胎或生殖细胞来修饰基因，控制和改变生物的遗传特征并传递给后代。目前，将Cas9和sgRNA导入受精卵多采用电转化或显微注射的方式，但在受精卵分裂过程中Cas9蛋白对不同卵裂球的编辑能力和修复方式可能不同，出现带有不同编辑类型细胞的嵌合体［46-48］。因此，如何正确利用CRISPR/Cas9技术提升人类的健康和福祉，是值得人们关注的焦点。

尽管目前还有许多技术难题有待解决，但CRISPR/Cas9技术仍在不断发展，基因编辑猪在农业育种、医学研究、人源化器官生产和临床疾病治疗等多个领域均取得突破性进展。这不仅为猪育种提供了全新的思路，也为生物医学研究提供了重要参考。采用基因编辑技术进行基因治疗必将成为21世纪人类攻克疑难病症的一种常规治疗手段，它必将为维护人类健康和畜牧业发展做出重要贡献。