活性氧对精子功能的影响及抗氧化剂应用于马精液保存的研究进展

胡玉玲，张 鲁，曾申明

（中国农业大学 动物科学技术学院，北京 100193）

人工授精（artificial insemination，AI）技术在动物育种中有至关重要的作用，是改善生产性状和提高遗传进程的重要手段之一，在一定时间内成功保持精子活力是AI的一项重要技术，能提高AI的效率。根据精液保存时的温度将精液保存分为冷冻保存、低温保存和常温保存。氧化应激是影响精液保存的重要因素。马精子主要依靠氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）而不是糖酵解产生能量，这种情况下精子线粒体的活性更高并易产生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），导致马精子比其他动物更容易受到氧化损伤。了解ROS的产生、功能及损伤机制，有利于为马精液保存提供理论依据。

1 精液中ROS的产生

ROS是生物有氧代谢的中间产物及电子转移反应的副产物，哺乳动物体内主要的ROS有超氧化物（O）、过氧化氢（HO）和羟基自由基（-OH）等。精液中ROS的主要来源是线粒体和白细胞，在线粒体呼吸链上，氧气逐步吸收4个电子，被还原成高反应自由基作为中间产物，最后还原成水，期间电子极易发生泄漏而形成大量氧自由基，因此OXPHOS活跃的精子产生的ROS较多。据估计，在线粒体呼吸过程中，有1%～2%的电子从呼吸链释放而形成超氧化物。ATP是维持精子内环境和功能的重要物质，精子内部ATP通过OXPHOS和糖酵解两种方式产生，前者依赖于精子中段的线粒体，后者主要发生在精子头部和纤维鞘。相比之下，OXPHOS能比糖酵解更快产生高水平ATP并促进精子活力，同时也伴随呼吸链上大量ROS的产生。大部分哺乳动物如人、小鼠等，主要通过糖酵解产生能量。以前的研究者普遍认为精子的代谢方式均为糖酵解，直到2010年发现马精子活力与线粒体膜电位有关，随后Z.Gibb等发现受线粒体抑制剂的影响，马精子的活力、运动速度及ATP的产生量都显著降低，而已知进行糖酵解的人类精子几乎不受到线粒体抑制剂的影响，首次证明马精子依赖于OXPHOS产生能量。因此，相比其他动物，马精子保存过程也更容易受到ROS的损伤。

精液中ROS的另一大来源是白细胞，主要发生在防御感染和炎症反应中，其产生ROS的机制与精子相同，但是生理上白细胞释放大量超氧化物的目的是杀灭病原体。正常情况下精浆抗氧化剂足以保护精子免受白细胞产生的ROS的影响，但是在稀释过程中精液通过离心和洗涤去除精清后，ROS的有害作用就变得更为明显。另外发现死亡精子也是精液保存中ROS的来源之一，精子死亡后氨基酸氧化酶活性增加并产生大量HO，产生的HO攻击精子造成氧化损伤。

2 ROS对精子功能的影响

2.1 ROS促进精子的功能

2.1.1 精子成熟 精子成熟过程中，组蛋白逐渐被鱼精蛋白取代，并形成分子间及分子内二硫键，从而将精子DNA封装到一个很小的体积中。ROS有助于二硫键的形成，影响精子蛋白质巯基氧化，并有助于鱼精蛋白和鞭毛蛋白的半胱氨酸残基之间形成巯基桥，引起染色质凝聚和获得渐进性的运动能力，确保染色体的稳定性并保护DNA不受损害。研究表明，鱼精蛋白2缺陷小鼠的精子抗氧化能力丧失，附睾精子在成熟过程中引发氧化应激介导的破坏级联反应

2.1.2 精子获能 精子射出后，要在雌性生殖道内经历超活化、获能、顶体反应、精卵识别等才能完成受精，任一环节不可缺少。精子获能需要ROS来完成蛋白磷酸化，如果这种磷酸化被抑制，精子获能就不会发生，会失去对各种生理性和非生理性激动剂的反应能力。精子内ROS是获能启动因子之一，可以通过增加腺苷酸环化酶（cAMP）水平、在细胞内启动细胞外信号调节激酶（ERK）通路两种方式促进获能。人类精子产生的ROS通过诱导细胞内cAMP水平的升高并随后激活依赖于蛋白激酶A（PKA）的酪氨酸激酶来刺激酪氨酸磷酸化。研究表明，ROS的产生对酪氨酸磷酸化有积极影响，抑制ROS产生会导致磷酸化酪蛋白含量显著降低，同时顶体反应和精卵融合能力变差。

2.1.3 顶体反应 顶体反应通过ROS诱导的酪氨酸蛋白磷酸化介导Ca流入，导致细胞内cAMP和PKA升高，从而使精子能够穿透卵母细胞膜并与卵母细胞融合。已经观察到ROS通过各种手段促进精子透明带的作用，包括3个质膜相关蛋白的磷酸化，进而催化脂肪酸的释放，诱导顶体膜和质膜融合。

2.2 ROS的病理作用

尽管ROS有促进精子成熟等生理功能，但ROS产生和抗氧化机制的任何不平衡都会导致精子发生氧化应激反应。而由于精子细胞质有限，抗氧化剂活性低，且不饱和脂肪酸含量高，因此精子特别容易受到氧化应激反应的影响。

2.2.1 脂质过氧化 为了成功受精，精子必须穿透透明带并与卵母细胞融合，大多数的多不饱和脂肪酸（PUFA）在调节精子的膜流动性中起主要作用，然而大量的双键容易被ROS氧化，因此精子极易受到氧化损伤。当精液中的ROS含量很高时会攻击PUFA引起一系列脂质过氧化反应，其中近60%脂肪酸流失，降低精子膜的流动性，使精子运动能力下降，并增加对离子的非特异性渗透及使膜结合的受体和酶失活而影响功能，使其不能与卵子融合，同时产生毒性醛，与硫醇基团形成加合物，破坏精子蛋白质和DNA的结构。

2.2.2 DNA损伤 精子发生过程中染色质浓缩发生错误会引起DNA受到氧化攻击，导致DNA损伤，ROS诱导的DNA损伤包括单链或双链断裂、碱基修饰和表观遗传学的改变及线粒体DNA损伤等，且线粒体DNA由于缺乏蛋白质的保护，比核DNA更容易受到攻击。ROS攻击DNA上的鸟嘌呤碱基，使其氧化生成8-羟脱氧鸟苷（8OHdG）加合物，这种碱基修饰浓度较高时能持续到第一次有丝分裂的S期，并影响后期胚胎的发育。

2.2.3 精子凋亡 在精子的内在凋亡级联过程中观察到的最早事件之一是线粒体ROS的生成突然增加，并伴随精子活力的丧失。R.J.Aitken等证明，由脂质过氧化作用产生的亲电子醛作用于精子的线粒体，以剂量和时间依赖性方式刺激线粒体超氧化物的产生，造成线粒体电子泄露，并降低琥珀酸脱氢酶活性和阻碍固有凋亡级联的后续活化，最终引起线粒体膜电位的丧失、DNA链的断裂和细胞死亡。若凋亡精子进入卵子就可能诱发突变，从而影响胎儿的发育和健康。

3 抗氧化剂在马精液保存中的研究进展

正常条件下，马精液中存在着稳定的ROS清除系统，通常称为抗氧化剂，包括酶类和非酶类物质，在清除ROS时这些成分相互协调、共同参与。在精液保存过程中，去除精清后向稀释液中加入各种抗氧化剂，包括维生素、氨基酸等，以达到抗氧化的目的。

3.1 马精液自身的抗氧化系统

马附睾中就含有丰富的抗氧化酶，对不同品种的马匹附睾成分进行分析发现，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的含量并没有差异，其含量从附睾头部到附睾尾部保持恒定，证实了附睾中抗氧化保护的重要性。精子在射精后进入雌性生殖道的瞬间，氧分压发生变化，并且接触到白细胞，从而加剧精子的氧化应激。为了抵消这种压力，精浆中含有丰富的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶（CAT）。在这些酶的作用下，精液中产生的ROS被还原成水，以减少对精子的损伤。此外，还含有少量的维生素C、尿酸、酪氨酸等，这些小分子物质也能够清除精浆中的自由基。

3.2 马精液稀释液中抗氧化剂的研究进展

3.2.1 酶类 在稀释液中添加适量的抗氧化酶能增强马精子的抗氧化能力，常添加的抗氧化酶主要是CAT、SOD和GPX，这三种酶也是精浆中的主要内源性抗氧化剂。在精液填充剂中添加等浓度的SOD、CAT和GPX能抑制半胱天冬酶-3的激活，并改善马精子在5℃条件下贮存72 h期间的活力和运动能力，但并不能防止ROS对DNA造成的损伤。单独添加SOD能提高马冻精解冻后的质量并减少细胞外调节蛋白激酶（ERK）的活化。但也有人发现稀释液中添加抗氧化酶对解冻后的马精子并没有显著改善，猜测可能精子内有足够的抗氧化物质保证精子免受ROS的毒害。

3.2.2 维生素类 维生素包含的种类很多，但在精液保存上应用最多的是抗坏血酸（维生素C）和生育酚（维生素E）。在低温保存的马精液中添加维生素C衍生物能够减少质膜的氧化损伤，提高精子的运动能力；添加维生素E能够减少脂质过氧化，提高精子活力并增强精液的受精能力。同时，在日粮中添加维生素E也能改善种马的精液质量。

3.2.3 氨基酸类 氨基酸本身在精液中具有较高的浓度，在精液保存中常添加的外源性氨基酸主要是半胱氨酸（Cys），作为谷胱甘肽（GSH）的前体，可通过介导合成GSH发挥功能，向稀释液中添加Cys能够预防氧化应激对精子的损害，提升精子的存活率，降低4-羟基壬烯醛的比例，抑制脂质过氧化。另外，在种马精液冷冻稀释剂中添加谷氨酰胺、脯氨酸能显著改善解冻后精子的活力和运动能力。

3.2.4 其他 马精子以OXPHOS为主要代谢方式产生能量，比其他动物的精子更容易受到ROS的攻击，因此可通过改变代谢途径抑制ROS的产生。有人提出若将马精子的能量代谢方式从以OXPHOS为主转变为以糖酵解为主，就能有效地抑制精子内ROS的产生，从而提高精子存活率。罗格列酮是一种具有非基因组活性的抗糖尿病药物，能够激活5′-单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）并促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达，增强组织对葡萄糖的摄取和利用。研究表明，它能提高马精子对葡萄糖的利用，使线粒体代谢转变为糖酵解途径，增加ATP的产生、提高精子的活力并减少ROS的产生。

4 小结

适量的ROS对于精子的生理功能不可或缺，能够促进精子的成熟、获能和顶体反应等，有利于精子和卵细胞的融合。正常生理条件下精子处于氧化平衡状态，精液中的抗氧化系统将ROS维持在较低水平。当这种平衡被打破，大量ROS产生造成氧化应激，对精子造成结构和功能上的损伤，使精子丧失与卵融合的能力。在马精液保存过程中需要加入各种外源性抗氧化物以降低精子的氧化损伤，延长精液的保存时间。但是各种抗氧化剂的保护效果并不相同，不同抗氧化剂相互协同或发生颉颃。总的来说，未来可利用马精子不同于其他动物精子的代谢方式寻找新型抗氧化剂，或根据ROS的产生和清除系统探索常规抗氧化剂。