原发性肝细胞癌中核因子κB、核仁蛋白14的表达及与临床特征的关系

李会平，代爱军，李亚辉，王帅，邢鲁奇

洛阳东方医院/河南科技大学第三附属医院1病理科，2消化内科，河南 洛阳 471003

3河南科技大学第一附属医院病理科，河南 洛阳 471003

肝癌是众多恶性肿瘤中恶性程度较高的肿瘤之一，是由多因素、多阶段、多步骤所致，此病具有高发病率、高病死率，严重情况下对患者生命安全造成严重威胁，其中原发性肝细胞癌是肝癌中最常见的类型，其恶性程度高、侵袭性强[1]。目前临床暂无治疗原发性肝细胞癌的特效药，多采取手术治疗、肝移植、射频消融治疗、经导管动脉化疗栓塞术以及放化疗等治疗手段，但近年来研究发现，由于肝癌起病隐匿、病程发展迅速、易转移复发等特点，导致多数肝癌患者预后不理想，其中早期没有特异性的临床表现以及缺乏早期的诊断手段是肝癌预后差的主要原因[2-3]。因此，发现早期有效生物学指标，在一定程度上有助于改善肝癌患者总体预后。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）与肿瘤的发生发展和侵袭转移关系密切；核仁蛋白14（nucleolar protein 14，NOP14）在乳腺癌、胰腺癌等肿瘤中已有相关研究；但关于NF-κB、NOP14在原发性肝细胞癌中的报道鲜少[4-5]。故本研究探讨NF-κB、NOP14在原发性肝细胞癌中的表达情况并分析其与患者临床特征的关系和临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年5月至2021年2月洛阳东方医院收治的原发性肝细胞癌患者的病历资料。纳入标准：符合《原发性肝癌规范化病理诊断方案专家共识》[6]中原发性肝细胞癌诊断标准；第一次发现并确诊为肝细胞癌且在接受根治性肝癌切除治疗前未行其他抗肿瘤治疗；手术所切除的肿瘤标本均经病理检查证实为原发性肝细胞癌。排除标准：既往有恶性肿瘤病史；合并其他类型恶性肿瘤；胆管细胞性肝癌、混合型肝癌以及转移性肝癌。根据纳入、排除标准，共纳入92例原发性肝细胞癌患者，其中男48例，女44例；年龄28～70岁，平均（46.13±19.39）岁；TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ～Ⅲ期44例；无门静脉癌栓49例，有门静脉癌栓43例；无淋巴结转移47例，有淋巴结转移45例；分化程度：中高分化42例，低分化50例。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

使用Western blot法检测NF-κB、NOP14表达：取肿瘤组织以及距离肿瘤组织5 cm以上的癌旁组织，对组织标本以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）进行冲洗后，行30 min裂解，离心处理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量，在2×十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，添加完成蛋白缓冲液后开始进行100℃加热5 min。凝胶电泳、转膜、取膜，4℃下固定、封闭处理1 h，将一抗使用0.05%～0.10%TBST稀释，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10%TBST洗膜3次，每次5 min，二抗被0.05%～0.10%TBST稀释（1∶10 000），摇动孵育时间为1 h，TBST连续洗膜3次，处理5 min。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参，分析NF-κB、NOP14蛋白与内参蛋白灰度值，计算目标蛋白以及内参蛋白灰度值的比值，进而分析NF-κB、NOP14蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF- κ B、NOP14相对表达量的比较

肿瘤组织中NF-κB、NOP14相对表达量均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 癌旁组织、肿瘤组织中NF- κ B、NOP14相对表达量的比较（±s）

表1 癌旁组织、肿瘤组织中NF- κ B、NOP14相对表达量的比较（±s）

组织癌旁组织（n=92）肿瘤组织（n=92）t值P值NF-κB 0.37±0.04 7.59±0.81 85.390<0.01 NOP14 0.43±0.06 9.35±0.97 88.040<0.01

2.2 不同临床特征原发性肝细胞癌患者肿瘤组织中NF- κ B、NOP14表达水平的比较

Ⅱ～Ⅲ期、有门静脉癌栓、有淋巴结转移、低分化原发性肝细胞癌患者的肿瘤组织中NF-κB、NOP14相对表达量均明显高于Ⅰ期、无门静脉癌栓、无淋巴结转移、中高分化原发性肝细胞癌患者，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表2）

表2 不同临床特征原发性肝细胞癌患者肿瘤组织中NF- κ B、NOP14表达水平的比较

2.3 NF- κ B、NOP14与临床特征的相关性分析

NF-κB、NOP14表达与原发性肝细胞癌患者TNM分期、门静脉癌栓、淋巴结转移及分化程度均呈正相关（P﹤0.01）。（表3）

表3 NF- κ B、NOP14与原发性肝细胞癌患者临床特征的相关性

3 讨论

据多项研究数据显示，肝癌在消化系统恶性肿瘤中病死率居第三位且是属于全球五大恶性肿瘤之一，其中原发性肝细胞癌是肝癌的常见类型，此病患者在早期时无典型临床症状，不易引起患者重视，但随着临床症状的显现，确诊时患者多处于中晚期且部分患者在初诊时已出现肝外转移[7-9]。随着科学发展和医疗技术水平的提升，肝癌在术前确诊的准确性、影像学与血清肿瘤标志物检查的便利性和准确性随之升高[10]。但至今肝癌患者的预后情况仍然较差，一方面与肝癌的恶性程度较高、易转移的特点有关，另一方面与缺乏有效的早期诊断手段有关[11-12]。故研究并发现有效的早期生物学标志物对肝癌的诊治具有重要意义。

NF-κB是一种核蛋白因子且具有多向转录调节作用，在细胞生理病理过程，如炎症、细胞增殖以及氧化应激中发挥着重要作用，若其被激活对凋亡基因的转录以及细胞凋亡起调节作用，可通过活化细胞核内DNA链、破坏效应性caspase 3蛋白、引起细胞结构解体等加剧细胞死亡的发生发展[13-15]。有研究显示，NF-κB信号通路的异常激活在众多类型肿瘤中均有所发现，这可能与肿瘤的发生发展以及转移密切相关，NF-κB在此信号通路中作为重要的通路调节因子之一，若受到外界刺激其核定位位点会因NF-κB磷酸化被暴露，随之NF-κB转移至细胞核，进而通过调控相关基因转录及表达，对细胞的生物学行为产生影响，有望成为疾病靶向治疗的新靶点[16-17]。高超等[18]研究报道，NF-κB在膀胱癌中与患者病理分级、临床分期存在密切关联，其中NF-κB高表达可能与肿瘤的恶性程度及侵袭能力有关，可作为膀胱癌的潜在分子标志物。在本研究中，NF-κB在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织，且与原发性肝细胞癌患者TNM分期、门静脉癌栓、淋巴结转移、分化程度密切相关，有望成为诊断原发性肝细胞癌的分子标志物，但在本研究中并未探讨NF-κB在原发性肝细胞癌中的具体作用机制，有待后续深入研究。

NOP14基因位于染色体4p16.317，多项临床研究报道，NOP14在黑色素瘤中呈异常高表达，对肿瘤细胞的发生发展具有促进作用[19-20]。杜永星等[21]在动物实验中发现，NOP14在胰腺癌肝转移灶中表达水平显著升高，其作用机制可能为NOP14促进肿瘤微血管形成和胰腺癌的生长和转移，加剧肿瘤恶性程度。研究显示，NOP14是多梳抑制复合物的靶基因，其高表达在肝癌的发生发展中发挥了重大作用，可促进肝癌的增殖、侵袭转移能力，进一步增强肿瘤的恶化程度，且与肝癌的早期筛查、诊断及预后密切相关[22]，说明NOP14具有作为肝细胞癌分子靶向治疗新靶点的潜力。在本研究中，NOP14在原发性肝细胞癌患者肿瘤组织中呈异常高表达且与患者临床特征密切相关，提示NOP14参与了原发性肝细胞癌的发生发展过程。

综上所述，原发性肝细胞癌患者肿瘤组织中NF-κB、NOP14呈异常高表达。同时相关性分析发现，NF-κB、NOP14表达与原发性肝细胞癌患者临床特征存在密切关联，测定NF-κB、NOP14表达对评估原发性肝细胞癌患者病情具有重要意义。但本研究样本量较小、患者来源受地域限制，且未对NF-κB、NOP14与原发性肝细胞癌患者预后的关系进行分析，缺乏深入研究，需进一步增加样本量进行多中心研究证实。