鸡血藤微型饮片的制备工艺研究

张颖奇，张凡，贾天柱

(辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600)

鸡血藤为豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤茎，味苦、甘，温，归肝、肾经。具有活血补血，调经止痛，舒筋活络的功效。可用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄[1]。鸡血藤中含有黄酮[2]、酚类[3]、甾醇[4]、木脂素类[5]、萜类[6]、挥发油类[7]化学成分，经现代研究分析，具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]、镇静、催眠[10]等作用。但鸡血藤传统饮片切片较大、较厚，临床使用时，饮片中有效成分难以煎出，又增加了临床调剂时的难度，因许多中药饮片都存在着该种问题，许多专家学者进行了有益探索，提出了中药新型饮片的概念，包括配方颗粒、超微饮片、破壁饮片等种类，有利于促进提高中药药物质量均一性及可控性，也使中药饮片的使用更加高效便利。但这些新的饮片药用形式，却脱离了组方合煎的中医用药理论，在此问题的基础上，辽宁中医药大学的贾天柱教授提出“微型饮片”的概念。中药微型饮片即在传统中药饮片的制片基础上，在外形上将饮片以大化小[11]，从而提高饮片的利用效率。中药微型饮片形式在临床调剂时，更满足多种药品煎煮的个性需求[12]，在中药的组方合煎、分级用药等用药理论方面也具有明显优势。本试验以此为基础，以加水量、粒径、闷润时长、干燥温度为影响因素，以煎膏率、成品率、流动性、活性成分煎出率为综合评价指标，优选出具有最佳有效成分煎出率和最大流动性的鸡血藤微型饮片，以推动微型饮片改革，建立规格严谨、智能调剂的中药微型饮片调剂体系，且进一步提高鸡血藤饮片有效成分的煎出率，提高饮片的利用率。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695-2998型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLERAE240型十万分之一天平(瑞士METTLER)；烘箱(WS70B-型)；FA1004B电子天平(上海精密仪器有限公司)。

1.2 药材 鸡血藤药材，购自安徽省六安市，并根据中国药典2020年版自行鉴定为豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤茎。

1.3 试剂与试药 儿茶素和表儿茶素购自大连美仑生物技术有限公司，批号分别为AF8030202和N1106AS，纯度均>98%；甲醇是色谱醇，其他试剂有乙醇，水是超纯水。

2 方法与结果

2.1 鸡血藤微型饮片煎出率的测定

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液的制备 精密称取儿茶素对照品5.19 mg，表儿茶素5.49 mg分别置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度后摇匀，分别制得0.207 6 mg·mL-1儿茶素和0.219 6 mg·mL-1表儿茶素的对照品溶液。

2.1.1.2 供试品溶液的制备 称取鸡血藤微型饮片5 g于250 mL锥形瓶中，加20倍水，直火加热，水煎液沸后用文火煎煮1 h，滤过后将药液置于恒重的蒸发皿中，于沸水浴上浓缩至干，用少许甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.1.2 色谱条件与系统适应性条件 色谱柱：Thermo C18色谱柱(4.6 mm×250 nm，5 μm)；流动相A：5‰醋酸-水，流动相B：甲醇。梯度洗脱：0～20 min，15% B；20～33 min，15% B变至25% B，流速为0.8 mL·min-1；检测波长为270 nm；室温检测[13]。对照品和供试品的HPLC色谱图见图1。

A.混合对照品；B.鸡血藤微型饮片供试品 1.儿茶素；2.表儿茶素图1 鸡血藤混合对照品及样品HPLC图

2.2 方法学考查

2.2.1 线性范围的考察 儿茶素线性范围考察：分别吸取儿茶素对照品1、2、3、5、8、10 μL，注入高效液相色谱仪(HPLC)中并测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为：Y=767 559X-16 054，r=0.999 9。表明儿茶素在0.207 6～2.076 μg的进样量范围内，呈良好线性关系。

表儿茶素线性范围考察：分别吸取表儿茶素对照品1、2、3、5、8、10 μL，注入HPLC中并测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为：Y=908 004X-47 226，r=0.999 9。表明表儿茶素在0.219 6～2.196 μg的进样量范围内，呈良好线性关系。

2.2.2 精密度试验 分别精密吸取“2.1.1.1”项下制备的儿茶素及表儿茶素对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，注入HPLC中，按“2.1.1”项下的色谱条件，测定其峰面积，结果得出儿茶素和表儿茶素峰面积RSD值分别为1.38%和1.54%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，测定各色谱峰面积，结果得出儿茶素和表儿茶素峰面积RSD值分别为1.25%和1.65%，表明24 h内，供试品的稳定性良好。

2.2.4 重复性试验 取6份鸡血藤微型饮片，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液。分别吸取各供试品溶液10 μL，按照“2.1.2”项下色谱条件，对6份样品中儿茶素和表儿茶素的含量进行测定。结果得出样品中RSD值分别为1.49%和1.35%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 精密称定已知儿茶素和表儿茶素的鸡血藤微型饮片6份，每份0.02 g，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入相应量的儿茶素对照品(0.207 6 mg·mL-1)和表儿茶素对照品(0.219 6 mg·mL-1)，按“2.1.2.2”项下的方法制备供试品，按照“2.1.1”项下的色谱条件测定含量，计算加样回收率，结果见表1～2。

表1 儿茶素的加样回收率测定结果

儿茶素的回收率在98.49%～101.76%之间，RSD为1.25%，符合有关规定。

表2 表儿茶素的加样回收率测定结果

表儿茶素的回收率在98.36%～101.39%之间，RSD为1.08%，符合有关规定。

2.3 鸡血藤微型饮片成品率的测定 鸡血藤常规饮片低温干燥，控制水分含量小于8%。取干燥后常规饮片药材100 g，使用清水闷软后，切制为微型饮片规格，控制含水量小于8%，称定鸡血藤成品微型饮片的质量，并计算其成品率[14]。

成品率%=微型饮片成品的质量(g)/药材质量(g)×100%。

2.4 鸡血藤微型饮片煎膏率的测定 取鸡血藤微型饮片5 g，于8倍量冷水中浸泡40 min，直火加热至水沸后，改为文火加热30 min，滤过后药液备用；取药渣，加6倍量水继续煎煮，水沸后改用文火煎煮20 min，滤过。两次滤过后的药液混合，定容至100 mL容量瓶中。精密称取50 mL，置于恒重的蒸发皿中，架于水浴锅上浓缩至干，再放入105 ℃的烘箱中烘干至恒重，称量所得煎膏重，计算煎膏率[14]。

煎膏率%=[煎膏重(g)×2]/微型饮片取样量(g)×100%

2.5 鸡血藤微型饮片流动性的测定 采用休止角法进行测定。称取20 g鸡血藤微型饮片，置于圆形容器中，倒扣，置于水平的桌面上，迅速地抬起容器，观察饮片自行滑落形成的倾斜角度。设倾斜角的高度为H，底边为L，计算微型饮片休止角为θ。

tanθ=H/L

2.6 正交试验 以加水量、粒径、闷润时长及干燥温度作为鸡血藤微型饮片的考察因素，各个因素设计了3个水平,具体因素的水平表见表3。试验以煎膏率、成品率、流动性以及儿茶素和表儿茶素的煎出率为考察指标,并根据每个指标的影响程度设计了正交试验。按照各项指标的贡献程度设定权重,并实行综合评价。正交试验设计表见表4，方差分析表见表5。

表3 因素水平表

表4 正交试验设计表

表5 方差分析表

由方差分析结果可知，因素D(干燥温度)是引起鸡血藤微型饮片中儿茶素和表儿茶素含量变化的主要因素；由极差分析结果可以看出，各项影响因素的影响顺序主次为D(干燥温度)>A(加水量)>C(闷润时长)>B(粒径)，从综合评分来看最佳工艺可以定位A2B3C1D2，但从方法分析来看因素B粒径大小在所设定的水平内没有显著性差异，故在节约时间与能源的考虑下，选择3水平。综合分析，确定鸡血藤微型饮片的最佳制备工艺为A2B3C1D2，即每100 g鸡血藤药材闷润加水量10 mL，粒径规格0.6～0.8 mm，闷润时长2 h，干燥温度60 ℃。

3 讨论

鸡血藤微型饮片流动性测量方法的选择。本试验考查鸡血藤不同规格粒径微型饮片的流动性时，发现不同规格的鸡血藤微型饮片，在流动时间测定仪中，会堵塞机器进出口，难以流下。因此选用休止角方法，根据饮片堆积层的自由斜面与水平面形成的最大角，来比较不同规格微型饮片的流动性大小，角度越小对应的该规格鸡血藤微型饮片的流动性越好。最终得出粒径为0.6～0.8 mm的微型饮片流动性最佳。

供试品溶液制备方法的选择。经查阅文献发现[15]，鸡血藤中儿茶素与表儿茶素在70%乙醇溶剂中提取度最高。但在临床使用时，鸡血藤微型饮片的煎煮溶剂为水而非醇提取，所以考虑到鸡血藤微型饮片在实际应用中的药用效果，本次试验在进行对鸡血藤中儿茶素与表儿茶素的含量测定时，选择使用水煎液而非醇提取。

含量测定指标的选择。中药鸡血藤饮片中含有原儿茶素、儿茶素、表儿茶素、甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素等化学成分，其中表儿茶素和儿茶素的含量较高，其他4个成分的含量相对较低[16]。现代研究表明，儿茶素是从鸡血藤乙酸乙酯活性部位中所提取的含量最高的单体化合物[17]，具有促造血、抗氧化、抗凋亡作用[18]；表儿茶素与儿茶素单体富集产生原青花素，展示出很强的抗氧化能力，能作为鸡血藤饮片等级评价的指标之一[17]。本次试验选用灵敏度高、重复性好且操作简单的HPLC法为对鸡血藤微型饮片中的表儿茶素及儿茶素进行含量测定，为鸡血藤不同规格微型饮片的质量标准提供一定的参考依据。

本试验以加水量、粒径、闷润时长、干燥温度为影响微型鸡血藤饮片的主要因素，并以这4种因素作为正交试验，以儿茶素和表儿茶素含量作为质量水平的评价指标，选出最佳的鸡血藤微型饮片炮制工艺。优选出的鸡血藤微型饮片的最佳炮制工艺为每100 g鸡血藤药材闷润加水量100 mL，粒径规格0.6～0.8 mm，闷润时长6 h，干燥温度60 ℃。

中药饮片是临床应用、调剂制剂、新药开发的前提和基础，必须有明确的基原，稳定的质量和可靠的疗效[19]。微型饮片与传统常规饮片相比，其饮片体积减小，同提取溶剂的接触面积变大，所以其有效成分的提取更完全，在煎出率水平上表现更优，达到了高煎出率，有利于临床的使用和中药研究。且由于其体积减小，流动性也更理想，更满足智能调剂的需求。饮片能达到高流动、高煎出，才能实现智能调剂和智能煎制[20-21]。故微型饮片具有广阔的临床应用和研究前景。