替格瑞洛中7个异构体的毒理评价及含量测定研究

漆欣筑，祝晶，何劼毅，聂鹏

(贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004)

替格瑞洛是一种新型环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，可通过激活P2Y12受体，可逆性地阻滞ADP介导的血小板活化和聚集，有效抑制动脉粥样硬化[1-3]。国际多中心PLATO 研究结果显示，替格瑞洛弥补了氯吡格雷抗血小板作用起效慢、个体差异性大等不足[4]。替格瑞洛于2010年12月由阿斯利康公司率先研制而成，2011年获美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于急性冠状动脉综合征的治疗[5]。替格瑞洛结构式为(1S,2S,3R,5S)-3-(7-{[(1R,2S) -2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-(硫丙基) -3H-(1,2,3)三唑( 4,5-d)嘧啶-3-基) -5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇[6]，具有6个不对称手性中心[7]，理论上将可能产生64种对映异构体[8]，但在实际合成过程中，只存在7种含量相对较大的异构体(见图1)。

图1 替格瑞洛各异构体

目前替格瑞洛已在全球超过85个国家获批上市，于2012年在中国获批上市。截至目前，该药在产厂家共有22家，共计40个批文，国内共有8家生产企业自拟了相关检验标准。由于各企业的合成方法和生产环节不一致，其控制的检验项目和限定参数均存在较大差异,其中仅有两个厂家对异构体的含量进行了控制。我们从临床用药安全的角度出发，认为有必要对该系列异构体的毒性进行全面评价，同时构建7个异构体的统一检验分析方法，并对其进行方法学试验研究；最后，基于我们建立的分析方法，对目前中国市场上在售的8个厂家生产的共计179批次替格瑞洛片的异构体进行含量分析。

1 软件、仪器与试药

1.1 软件版本 ADMET 性质预测软件ADMET PredictorTM(Version 10.0,美国Simulations Plus公司)；Gastroplus数据库(Version 9.8.2000)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪(型号：e2695，美国Waters公司)；XS-205型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；超声仪(型号：KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)；纯水机(UPL-I-30EZ，四川优普超纯科技有限公司)。

1.3 试药试剂 乙腈(批号：20025138，美国TEDIA试剂公司)；甲醇(批号：21015240，美国TEDIA试剂公司)；正己烷(批号：160830，昌泰兴业有限公司)；无水乙醇(批号：210302，天津市科密欧化学试剂有限公司)；三氟乙酸(批号：20210503，天津市科密欧化学试剂有限公司)；替格瑞洛对照品(批号：430050-202101，中国食品药品检定研究院)；替格瑞洛7个异构体对照品均来源于Sinco Pharmachem；自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 毒理预测结果 从总体情况看，替格瑞洛该系列异构体的毒性预测打分均低于2.0，即毒性较小。但各异构体生不良反应的可能性都较高，应注意控制剂量，最大推荐治疗剂量MaxRTD(针对一般成年人体)需低于3.16 mg·(kg·d)-1。该系列异构体在环境毒性、内分泌毒性、心脏毒性、急性毒性、基因毒性方面均无相关毒性。过敏性预测方面，均无呼吸过敏性。致癌性预测方面(Rat TD50和Mouse TD50)，均有产生小鼠致癌性的可能。生殖毒性预测方面(Repro Tox)，异构体Y2有产生生殖毒性的可能性。肝脏不良反应预测方面，各杂质均有潜在的肝脏毒性(见表1)。

表1 异构体毒理评价预测结果

2.2 常规检验 本次涉及的8个厂家中，只有两个厂家(厂家A与厂家B)的检验标准对制剂中的异构体含量进行了控制。其中厂家A控制了Y1和Y2(限度均为≤0.2%)，厂家B控制Y1、Y2和Y2′(限度Y1≤0.2%，Y2+Y2′≤0.2%)。有5个厂家(厂家C、D、E、F、G)的原料药为自己合成，其中两家企业在原料药标准中对异构体的含量进行了控制，各厂家原料药标准中异构体的含量控制具体情况见表2。

表2 各厂家原料药中异构体控制情况

2.3 方法学验证试验 在含量测定的检验项目中，用异构体对照品进行试验，检测异构体是否会在检验条件下，影响替格瑞洛主峰的含量。结果表示在各厂家相应标准的含量测定条件下，异构体Y1、Y2和Y2′和主峰的出峰时间一致，其含量会影响主药的含量控制。异构体Y3、Y3′、Y4、Y4′和主峰可以分开。

2.3.1 色谱条件 仪器及色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Waters e2695，色谱柱：Chiralpak AD-H，流动相：正己烷∶无水乙醇∶三氟乙酸(85∶15∶0.2)，检测波长：255 nm，柱温：40 ℃，流速：1.0 mol·L-1，进样量：10 μL。

2.3.2 溶液配制 系统适应性溶液的配制：分别取替格瑞洛对照品和7个异构体对照品适量，用无水乙醇溶解并制成每1 mL含各异构体均为10 μg，替格瑞洛为2.0 mg的混合溶液。作为系统适应性溶液。

供试品溶液的配制：取本品细粉适量(约含替格瑞洛50 mg)，置100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

对照溶液的配制：取供试品续滤液1 mL至200 mL，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。

2.3.3 专属性试验 系统适应性结果：各成分出峰顺序依次为：Y4、Y3′、Y3、替格瑞洛、Y2′、Y2、Y4′、Y1。各峰之间且与主峰之间分离度符合要求，空白溶剂无干扰(见图2)。

图2 系统适用性图谱

2.3.4 检测限及定量限试验 定量限：各取异构体对照品适量，用无水乙醇溶解并稀释成每1 mL中约含各异构体均为2 μg的溶液，调整进样量，得各异构体的定量限和检出限。此检验方法能满足含量0.001%的异构体检验(见表3)。

表3 各异构体检出限及定量限

2.3.5 异构体含量分析 经本方法检测，8个厂家179批样品中，其中厂家C、D、E、F、G、H的样品中均未检出，厂家A样品中检出Y2，厂家B样品中检出Y1、Y2(见表4)。厂家A与厂家B的3批次样品检验结果与常规检验结果基本一致(见表5～6)。

表4 各异构体含量

表5 厂家A 3批次样品中的异构体含量

表6 厂家B 3批次样品中的异构体含量

3 讨论

根据ICH M7指导原则的要求，对于药物中杂质的毒理学研究，除采用试验数据外，同时也认可(定量)构效关系[(Q)SAR]评价结果。按照指导原则的要求，对于药物的遗传毒性杂质，我们主要关注其致突变性。ADMET predictor分析结果显示，替格瑞洛的各异构体均存在不良反应的可能性和肝脏毒性，建议各药品生产企业严格控制该药品摄入量。同时，各异构体均存在引起心脏毒性和小鼠致癌的可能性，异构体Y2可能存在生殖毒性。基于ICH M7的要求，我们有必要对该系列异构体进行研究和控制。但ADMET predictor在对药物毒性进行分析时，主要是基于该药物化学结构中是否存在相关的毒性警示结构，因此使用该软件在对同分异构体进行毒性分析时，并不能完全区分异构体间的不同的毒性。因此，建议药品生产企业深入研究该系列异构体的毒理学研究，重点关注相关异构体和不良反应症状之间的关联、动物实验中动物给药量与肿瘤生成的内在联系，论证异构体控制的必要性和相关限度。

通过该高效液相方法，替格瑞洛相关异构体与主峰和其他杂质峰分离度良好，能在同一条件同一系统里区分该7个异构体与主成分，专属性强。该系列异构体的检测限为4～8 ng，定量限为10～16 ng，能有效辨别异构体的种类和分析药品中各异构体的含量。该方法专属性强、操作简单、检验效率高。经本方法检验，企业B检出异构体Y1，企业A、B检出异构体Y2，各异构体的含量低于限度(0.1%)，均在可控范围内，其结果为符合规定，其他企业未检出有关异构体。各企业的多批次样品的结果偏差也较小，产品稳定性均较好，检验同一厂家的三批次药品，其Y1、Y2含量的偏差均较小，说明该系列企业的合成路径设置均较为合理，分离纯化方法也较为彻底，能有效地去除原料药中的相关异构体杂质。按此方法检验，可有效地辨别和测定该药品的相关异构体，为高效检验和控制该药品的质量提供了方法借鉴和数据支撑。