春秋冬三季东弗里升奶绵羊体内胚胎生产及移植效果

2022-07-09马文奎李继成谭鑫星张金龙张效生姬鹏云李广栋宋玉坤吕东颖杨明辉富俊才阿布力孜吾斯曼朱士恩刘国世

黑龙江动物繁殖 2022年1期

马文奎，李继成，谭鑫星，张金龙，张效生，吴昊，姬鹏云，李广栋，宋玉坤，杨海，吕东颖，杨明辉，富俊才，阿布力孜·吾斯曼，朱士恩，刘国世*

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；3.北京奥鑫牧业有限公司，北京 101300；4.内蒙古草原宏宝食品股份有限公司，内蒙古巴彦淖尔 015000；5.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300380）

东弗里升奶绵羊（East Friensian milk sheep）以产奶能力强而著称，原产于德国东北部。该品种体格较大、体型结构良好；公、母羊均无角，被毛白色，体躯宽而长，腰部结实，肋骨拱圆，臀部略有倾斜，尾瘦长、无毛；乳房、乳头发育良好，优秀母羊年泌乳量达1 200 kg以上。早年我国东北、西北地区引进过东弗里升奶绵羊，但存栏量较少。胚胎移植（embro transfer，ET）技术是普遍使用的良种快速扩繁手段，可充分发挥优良种畜在品种改良和种群扩繁中的潜力。胚胎移植效率的高低不仅受供受体年龄、环境条件、激素剂量的影响，还与季节的变化具有一定的相关性。前期研究表明，不同季节对无角道赛特、特克塞尔和德国美利奴供体羊的胚胎数、黄体数和可用胚胎数没有影响，但是胚胎的可用率秋季显著高于春季。夏季较为炎热，手术容易造成感染。因此，本试验在春、秋、冬三季对东弗里升奶绵羊进行同期发情—超数排卵—手术冲胚—胚胎移植，对收集的胚胎进行鉴定、统计和分析，并统计妊娠率和产羔率，旨在探究春、秋、冬三季进行东弗里升奶绵羊体内胚胎生产和移植的效果是否有差异，以揭示季节变化对东弗里升奶绵羊胚胎移植效果的影响。

1 材料

1.1 试验动物

2018年4月份（春季）选用内蒙古草原宏宝食品股份有限公司的12只进口东弗里升奶绵羊为供体，85只本地乌珠穆沁羊为受体；2018年9月份（秋季）选用45只东弗里升奶绵羊为供体，373只乌珠穆沁羊为受体；2018年12月份（冬季）选用42只东弗里升奶绵羊为供体，476只乌珠穆沁羊为受体。供体母羊平均体重在53～88 kg之间，供受体母羊年龄均为2～3岁，胎次均为3～5胎，体况良好，无繁殖疾病。采精公羊性欲旺盛，精液品质优良，精子活力大于0.6。

1.2 药品与试剂

促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黄体素（luteinizing hormone，LH）、孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），购自宁波三生生物科技有限公司；EAZI-BREED-CIDR（20个/袋）、Holding培养液（50 mL/袋），购自北京绿欣康农牧科技有限公司；75%乙醇、碘伏、高浓度新洁尔灭、磺胺、维生素A-D、林可霉素、生理盐水等，均为市购。

1.3 设备和器械

采精设备（假阴道）、精液品质检测显微镜、内窥镜输精设备、手术架、冲卵管、恒温板、体视镜（型号为SZ61，购自OLYMPUS公司）、B超仪（型号为RKU10，购自徐州市凯信电子设备有限公司）、手术刀柄、直剪、止血钳、子宫钳、创巾钳等。以上仪器、设备、用品均由中国农业大学动物科学技术学院动物遗传育种与繁殖重点实验室提供。

2 方法

2.1 供体羊超数排卵

采用CIDR+FSH+PMSG法进行超数排卵。第0天对供体羊埋置CIDR栓，同时肌肉注射3～5 mL维生素A-D。埋栓后第10天晚上18：00给供体羊注射FSH，采用7针注射法依次递减，分别在06：00和18：00进行注射，根据体重和手术次数调控剂量，总剂量区间为300～500 IU/只，第13天18：00注射最后一针FSH，同时取出CIDR栓，取栓12 h后立即注射PMSG 330～450 IU/只。

2.2 精子的采集与供体羊配种

供体羊在取栓后48～54 h进行腹腔镜人工输精。将无传染性疾病、性欲旺盛的公羊生殖器部位用纱布擦拭干净，采精前找一只发情母羊，利用假阴道采集精液。提前组装好内窥镜设备、输精枪、手术器械及创巾等。首先，做好消毒工作，将内窥镜用新洁尔灭清洗干净，输精枪用生理盐水清洗干净；其次，在备好表皮的前提下进行开口，位置在距离供体羊乳房下侧8 cm左右，一般两侧对称开口；最后，左手持内窥镜探入羊腹腔找到子宫角，右手利用准备好的输精枪将公羊精液输入两侧各2孔，每孔输精0.2 mL。

2.3 受体羊的处理和腹腔镜胚胎移植

受体羊采用CIDR+PMSG法与供体羊同步埋栓，且同时取栓，第13天取栓时肌肉注射PMSG，剂量为330 IU/只。取栓后24～36 h试情，记录受体羊发情情况。5～6 d后进行胚胎移植，采用腹腔镜观察受体羊子宫两侧，单侧发现1～3个黄体则可进行移植，移植后肌肉注射土霉素3～5 mL消炎。

2.4 供受体羊术后管理

供受体羊术后分栏饲养，均衡营养，供给足量的清洁饮水，圈舍内保持干燥整洁，防止术后感染。观察1～2 d。

2.5 测定项目

腹腔镜输精5～6 d后，采用手术法从供体羊子宫角冲胚，冲胚时记录左右侧黄体数，在40倍体视显微镜下捡出胚胎，剔除未受精卵，计数胚胎数，观察胚胎状态、色泽、大小、数量、饱满度、桑椹胚及囊胚数。在受体羊胚胎移植45 d后进行B超妊娠检查，按照冲胚记录统计单胚移植和双胚移植妊娠数，统计妊娠率。145 d后分娩，记录产羔数，产羔率。

2.6 数据的统计分析

试验数据先用Excel归类汇总，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

3 结果与分析

3.1 不同季节对东弗里升奶绵羊超数排卵黄体数的影响

在东弗里升奶绵羊供体羊腹腔镜输精后5～6 d进行手术冲胚，结果表明：供体羊左侧黄体数为春季10.08枚，秋季8.18枚，冬季9.07枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）；右侧黄体数为春季7.50枚，秋季7.36枚，冬季8.14枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）；总黄体数为春季17.58枚，秋季15.53枚，冬季17.21枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）；春、秋、冬三季东弗里升奶绵羊左侧黄体数、右侧黄体数和总的黄体数差异不显著（P＞0.05）。具体见表1。

表1 东弗里升奶绵羊超数排卵黄体数测定结果Table 1 Superovulation corpus luteum number in East Friensian sheep

3.2 不同季节对东弗里升奶绵羊超数排卵回收卵数和可用胚胎数的影响

在东弗里升奶绵羊供体羊腹腔镜输精后5～6 d进行手术冲胚，结果表明：供体羊左侧子宫回收胚胎数为春季5.92枚，秋季7.76枚，冬季6.33枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）；右侧子宫回收胚胎数秋季（8.53枚）显著高于春季（5.08枚）和冬季（5.69枚，P＜0.05）；回收胚胎数秋季（16.33枚）显著高于春季（10.42枚）和冬季（12.19枚，P＜0.05）；可用胚胎数为春季9.08枚，秋季11.56枚，冬季9.36枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）。说明秋季进行东弗里升奶绵羊体内胚胎生产效果最佳。具体见表2。

表2 东弗里升奶绵羊超数排卵回收卵数和可用胚胎数测定结果Table 2 The number of eggs recovered from superovulation and the number of available embryos in East Friensian sheep

3.3 不同季节对东弗里升奶绵羊超数排卵胚胎质量的影响

在东弗里升奶绵羊供体羊腹腔镜输精后5～6 d进行手术冲胚，体视镜下观察胚胎质量，结果表明：桑椹胚数为春季4.50枚，秋季6.98枚，冬季5.48枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）；囊胚数为春季4.08枚，秋季4.33枚，冬季3.60枚，季节间均差异不显著（P＞0.05）。说明春、秋、冬三季东弗里升奶绵羊超数排卵所获得的胚胎质量没有差异。具体见表3。

表3 东弗里升奶绵羊超数排卵胚胎质量测定结果Table 3 The quality of superovulated embryos in East Friensian sheep

3.4 不同季节东弗里升奶绵羊受体移植不同数量胚胎对妊娠率的影响

在东弗里升奶绵羊供体羊腹腔镜输精后5～6 d后对供体母羊进行胚胎回收，用腹腔镜给受体羊进行胚胎移植，在移植45 d后进行妊娠检查。结果表明，单胚移植妊娠率秋季（63.34%）和冬季（58.99%）显著高于春季（32.79%，P＜0.05），双胚移植妊娠率秋季（86.21%）显著高于冬季（50.00%，P＜0.05）。具体见表4。

表4 东弗里升奶绵羊胚胎移植妊娠率测定结果Table 4 The pregnancy rate of East Friensian sheep by embryo transfer

3.5 受体移植对妊娠率和产羔率测定结果

在给东弗里升奶绵羊进行胚胎移植45 d后进行妊娠检查，结果表明：妊娠率为秋季（66.21%）高于春季（51.76%）和冬季（60.71%），季节间均差异不显著（P＞0.05）；产羔率为春季（68.18%）高于秋季（67.83%）和冬季（65.13%），季节间均差异不显著（P＞0.05）。说明春、秋、冬三季东弗里升奶绵羊产羔率没有差异，但秋季东弗里升奶绵羊胚胎移植妊娠率最高。具体见表5。

表5 东弗里升奶绵羊胚胎移植妊娠率和产羔率测定结果Table 5 The pregnancy rate and lambing rate of East Friensian sheep by embryo transfer

4 讨论

4.1 影响超数排卵因素分析

供体羊超数排卵效果与品种、年龄、饲养方式、季节、超排程序、激素、剂量等息息相关。高立芳等发现，采用CIDR+PG+FSH法进行酉州乌羊超数排卵，5月份获得的可用胚胎（11.76枚）显著高于12月份（8.52枚，P＞0.05）。袁玉国等报道，对徐淮白山羊进行超数排卵，供体可用胚胎数4—6月份（15.55枚）显著高于10—12月份（13.15枚，P＞0.05）。本试验结果表明，东弗里升奶绵羊供体羊可用胚胎数春季（9.08枚）、秋季（11.56枚）、冬季（9.36枚）之间差异不显著（P＞0.05），与高立芳和袁玉国等的研究结果有所不同，可能是由于品种、环境、激素状况不同等原因造成。代相鹏等对波尔山羊进行超数排卵，结果表明，4月份可用胚胎数（12.40枚）与11月份（12.80枚）差异不显著（P＞0.05），4月份黄体数（22.80枚）与11月份（17.60枚）差异不显著（P＞0.05）。本试验结果表明，可用胚胎数春季（9.08枚）、秋季（11.56枚）、冬季（9.36枚）之间差异不显著（P＞0.05），黄体数春季（17.58枚）、秋季（15.53枚）、冬季（17.21枚）之间差异不显著（P＞0.05）。这与代相鹏等的研究结果一致。易金云对黑萨福克和杜泊供体母羊使用CIDR孕酮栓进行同期发情，采用FSH+PMSG 7针递减法进行超数排卵，结果显示，春季平均黄体数（16.80枚）高于秋季（10.20枚）。本试验结果表明，东弗里升奶绵羊供体羊平均黄体数春季（17.58枚）高于秋季（15.53枚），本试验所用超排程序和季节处理与易金云等的试验一致，获得的黄体数结果也一致。

4.2 单胚移植和双胚移植对妊娠率的影响

在羊同期发情、超数排卵及胚胎移植过程中，卵泡成熟后如若受精则形成妊娠黄体，黄体通过分泌孕酮来维持母畜妊娠。因此，如果胚胎移植受体卵巢上形成的黄体数量较多妊娠率则高。胚胎质量的优劣及胚胎移植数量都是影响胚胎移植效率的重要因素。张红等研究表明，移植胚胎的数量是决定妊娠率和胚胎存活率的关键因素。陈建泉等研究表明：移植2枚胚胎效果最佳，受体移植双胚的妊娠率和胚胎存活率比移植单胚的高10%～15%；且2枚胚胎同时移植到黄体侧，要比分别移植于两侧子宫角的妊娠率高。韩红叶等研究发现，桑葚单胚移植妊娠率（71.80%）显著低于双胚移植妊娠率（82.4%，P＜0.05），囊胚单胚移植妊娠率（48.20%）显著低于双胚移植妊娠率（58.30%，P＜0.05）。本试验结果表明，双胚移植妊娠率为春季（75.00%）、秋季（86.21%）高于冬季（50.00%），与高志敏等及李俊杰等的研究结果一致。此外，本试验中的供体母羊在腹腔镜输精后5～6 d时进行手术冲胚，此时胚胎发育为桑葚胚和囊胚，更易附植，更适于受体子宫内环境。该结果与洪琼花等和K.F.Breuel等的报道一致。张金龙等的试验结果表明，不论是囊胚还是桑葚胚，均是移植2枚胚胎的妊娠率显著高于移植1枚胚胎。本试验结果表明，春秋两季双胚移植优于单胚移植，冬季则没有表现出这种优势。