猪精子冷冻保存技术的研究进展

左晓宇，任 尚，吴方超，汝振远，张翔栋，焦 俊，张晓东，张运海*，曹祖兵*

（1.安徽农业大学 动物科技学院地方畜禽遗传资源保护与生物育种安徽省重点实验室，合肥 230036；2.安徽省浩宇牧业有限公司，安徽 六安 237451）

随着生活水平的不断提高，人们对于猪肉的需求量越来越大，猪肉在肉类生产中的占比已经达到了37%［1］，生猪产业也成为我国畜牧业发展的主导产业［2］。受非洲猪瘟疫情的影响，我国的一些地方猪品种面临灭绝危机［3］。地方猪品种遗传资源保护工作势在必行，而冻精技术已成为保种工作中用来保存公猪基因必不可少的一环［4-5］，因此冻精技术在保种上有着重要的意义。

众所周知，猪肉是我国人民必不可少的一种食物，猪肉的生产关乎我国广大人民的饮食安全。养猪业既要防范生物安全危害，又要扩大母猪繁育，重视安全的同时也要扩大养猪规模。为了避免生物危害且能快速扩大生产规模，利用猪冷冻精液保存技术结合低剂量子宫深部输精和性控精液技术进行引种配种在当今的大环境下显得尤为重要。

1 猪精液冷冻保存技术发展过程

冷冻精液是指在超低温条件下（液氮、-196℃）使精子代谢停止，从而达到长期保存的固态精液［6］。经解冻后的精子可以采用人工授精、体外授精技术进行利用。精液冷冻保存的研究已有很长的历史，早在1787年，意大利科学家首次尝试将马精液放在-17℃雪中进行冷冻，在解冻后发现有少量精子存活［7］。20世纪30年代首次将蟑螂和哺乳动物精液放到乙醇和雪的混合物中并使温度降到-23℃，结果显示，解冻后仍有一些活着的精子［8］。20世纪40年代英国科学家polge首次发现甘油对冷冻精子有保护作用。此后精子的冷冻保存技术便迎来了突破，使得精子冷冻技术取得了巨大的发展。随后人们又将液氮冷冻应用于冻精［4］。1962年日本人永赖发明了颗粒冻精，随后法国卡苏公司又发明了冻精细管，并很快推广到了全世界。之后研究者在不同动物中进行精液冷冻保护试验，均取得了一定的成功。猪精液冷冻在20世纪70年代已经开始，但是利用猪冷冻精液进行输精所占的比例依旧很低，只有不到1%［9］。现今猪冷冻精液技术主要应用于远距离跨国引种和珍贵猪种的保种工作。

2 猪精液冷冻保存技术关键点

2.1 冷冻保护液与冷冻保护剂的选择

常用的猪冻精冷冻保护液有两种：以葡萄糖为基础配制的冷冻保护液和β-半乳糖为基础配制的冷冻保护液。两者都常以甘油等成分作为冷冻保护剂，并加入20%卵黄和其他成分。制作冻精时使用的保护液有预稀释液、冷藏保护液（Ⅰ液）和冷冻保护液（Ⅱ液）。猪精液冷冻常使用两步稀释法，即在稀释后的鲜精中依次加入Ⅰ液和Ⅱ液。研究表明，冷冻保护液中添加不同浓度、不同类型的冷冻保护剂，冻精质量相差很大［10-12］。

常用的冷冻保护剂有以下几种：（1）甘油（ply）。甘油是一种无色透明、脂溶性油状液体，易穿过细胞膜，能在冷冻精子时减少精子内部冰晶的形成。使用甘油冷冻精子时需要注意甘油浓度，太低起不到保护精子的作用，太高会影响解冻后精子的受精能力、顶体完整性、活率，使精子冻后质量变差［13］。此外，研究还发现猪精子在5%～7%甘油中保存10 h会降低受胎率［14］，使用甘油作为冷冻保护剂时在Ⅱ液中添加的适当甘油浓度为3%。除此之外，温度也是甘油使用时需要注意的因素。研究证实，甘油在5℃时能提高猪精子活力，在15℃时会降低猪精子活力［14］。因此，在添加Ⅱ液降温到4℃后需要控制好温度，避免升温影响冻精质量。甘油是冻精制作中主流的冷冻保护剂。研究表明，采用甘油作为冷冻保护剂制作的冻精，结合低剂量子宫内深部输精技术进行输精，母猪受胎率、产仔数均达到了常温精液水平［9］。（2）二甲基亚砜（DMSO）。DMSO常作为细胞冷冻的冷冻保护剂、膜渗透剂进行使用［12］，也在冻精中使用。DMSO在鱼类冻精中使用获得了不错的效果，DMSO浓度为10%～20%时受精率达到77%［15］。兔精液使用DMSO冷冻复苏后精子活力可以达到60%［16］。有研究者在山羊冻精的冷冻保护剂中加入不同浓度的DMSO进行对比，结果表明，添加最高浓度（1.75%）的DMSO后，精子冻后复苏活力达到了41.2%［17］。DMSO虽然可以降低精子畸形率，提高顶体、脂膜完整率，但解冻后精子活率有所下降［12］。有研究表明，DMSO对猪精子的毒性很大，在猪冻精中使用DMSO需要慎重［18］。（3）乙二醇（EG）。乙二醇常被用作防冻剂，也被用作冷冻保护剂。在山羊冻精中有学者用6%甘油和5%EG作为冷冻保护剂进行对比，结果表明，EG组比甘油组精子活力提高10%。这是由于EG分子比甘油分子小，渗透性能高于甘油［19-20］。据报道，在绵羊冻精中添加EG，结果表明，EG终浓度为5%时效果最好［21］。在牛冻精中添加7%EG精液冷冻效果最好［22］。研究表明，在猪冻精生产中EG的冷冻保护效果优于其他类型冷冻保护剂［18］。因此作为一种新型的冷冻保护剂，未来EG在猪冻精生产中将会拥有不可替代的作用。（4）丙二醇（PG）。丙二醇也具有一定的冷冻保护作用，其渗透能力弱于EG，高于甘油［23］。有学者使用大黄鱼的精液测试PG的冷冻保护效果，结果表明，PG的冷冻保护效果不如甘油、DMSO、EG［24］。也有学者使用兔精液进行测试，得出了类似的结果［25］。因此，推测猪冷冻精液中PG冷冻保护效果不如甘油、EG。（5）N-N-二甲基乙酰胺（DMA）。DMA也可作为冻精的冷冻保护液使用。研究表明，在鸡精液冷冻过程中添加DMA的最适浓度是10%，但是其冷冻后精子活力只有甘油组的一半［10］，当使用10%DMA与6%甘油混合使用时，其冻后精子活力高于单独使用甘油［10］，但目前DMA在猪冻精中使用较少。

2.2 冷冻方法

冷冻精液方法有两种，一种是慢速冷冻（缓慢降温后熏蒸冷冻或程序化冷冻），另一种是玻璃化冷冻（快速冷冻）。慢速冷冻主要是将精子置于含有保护剂的溶液中，利用程序化冷冻仪产生的液氮冷气进行冷冻。玻璃化冷冻则是使用高浓度冷冻保护剂与精子混合后直接放进液氮进行冷冻。在某些物种中玻璃化冷冻精子的冻后效果较好，因为冷却速率足够快而减少了精子的冰晶损伤［26-29］。有报道称，海藻糖和蔗糖玻璃化冷冻精子活力为30%［28］，但是这与冻精实际使用所要求的活力相差甚远。在各种动物精子中猪精子对冷冻保护剂毒性、渗透压、活性氧、低温的变化更加敏感。原因与猪精子质膜成分有关，猪精子质膜上胆固醇与磷脂、蛋白质与磷脂的比例分别为0.26和1.26，这让猪的精子质膜的稳定性降低，导致其抵抗低温的能力下降［30-32］。因此，在实际生产中一般都借助于程序化冷冻仪的慢速冷冻（程序化冷冻）方法进行猪精液的冷冻。

程序化冷冻步骤：将采集的新鲜精液进行质量检测，品质合格的精液与冻精预稀释液1∶1混合，置于室温（25℃）下平衡1～2 h，随后把平衡好的精液放入装有常温水的泡沫盒中水浴降温2 h至17℃。将降温好的精液放到大容量离心机，800×g离心12～20 min。离心好的精液去除上清液，加入Ⅰ液，加入Ⅰ液的量（mL）=［总精子数（亿）×活力÷目标密度（亿/mL）］÷2；总精子数=精液密度（亿/mL）×精液体积。加入Ⅰ液后放入4℃冰箱中水浴降温2.5～3.0 h。降温完成的精液在4℃环境中加入同为4℃的Ⅱ液。用喷码罐装一体机在4℃进行罐装之后用程序冷冻仪进行冷冻，冷冻程序：4～-5℃100 s；-5～-80℃113 s；-80～-150℃70 s［33］。需要注意的是在冷冻完成后冷冻仪应启动加热程序除霜。冷冻好的冻精装入拇指管，再装入束口布袋中，置于放入液氮罐中储存。

2.3 解冻方法

用长镊子从液氮中夹出冻精麦管，迅速放入水浴锅中，麦管放入水浴锅的同时用事先准备好的计时器计时，同时镊子夹住麦管在水浴锅中不停晃动，待计时结束迅速取出麦管，并用事先准备好的吸水纸快速擦干。擦干后将冻精封口端剪开，之后使用麦管推针从棉塞端将解冻后的冻精推入到事先准备好的稀释液中（稀释液应提前放入37℃水浴锅中预热）。冻精推入稀释液后应轻轻摇匀，之后放到37℃水浴锅中平衡5～10 min。平衡好的冻精置于精子分析仪中检测，并做好记录。注意0.25 mL的麦管在50℃水浴锅中解冻7～8 s，0.5 mL的麦管在50℃解冻10～15 s。解冻方法不只有50℃这一种方法，还有接近体温的解冻方法。有学者分别用38.5，39.0，39.5，40.0℃，每组时间分为10，20，30 s解冻精子，发现冷冻后精子在39.5℃条件下解冻30 s的活力最高［34］。在猪冷冻精子解冻过程中，有学者分别在38℃20 s，42℃20 s，50℃15 s，62℃5 s解冻精子，结果表明，38℃20 s解冻效果最好，其次是62℃5 s［35］。也有研究表明，猪冻精在50～60℃中解冻效果最好［36］。这可能是由于较高温度解冻时精子能快速通过危险区［37］。解冻时应当特别注意的是解冻时间要准确，尤其是在采用较高温度进行解冻时，要求技术人员对时间的把控要非常精准。

2.4 冻精生产关键环节的优化

在猪冻精生产过程中，还可以通过保护剂成分的改良和精子筛选等手段提高猪冻精质量。

（1）使用双糖配制冷冻保护液：在实际生产中配制冷冻保护剂时往往使用双糖而不是多糖，因为有研究证实双糖的冷冻保护效果要优于多糖［38-39］。（2）注意精液的质量检测：选用鲜精时要注意鲜精气味、色泽、活力等指标。（3）分离死精。精液中的死精也应当引起重视，已有研究证实精液中的死精会释放活性氧（ROS），从而导致冻后精液质量变差［40-41］。因此，分离死精理论上可以提高冻精质量。分离死精常使用密度梯度离心法［42］或上游法［43］，也可利用磁力选择来分离死精和选择精子［44-46］。（4）水分子磁力修饰。有学者为了减少精子冷冻过程中冰晶的形成，尝试对水分子进行磁力修饰来改变水的分子结构，从而改变水的结晶温度，这使精子的冻后活力得到提高［47］。（5）减少冷冻过程中精子的死亡。有些科研人员对离心过程进行优化，在精子离心瓶中添加碘化钾气垫来减少离心对精子产生的冲击，这种方法能使精子冻后活率上升0.5%［48］。（6）添加利于抗冻的成分。例如添加褪黑素、白藜芦醇、红景天多糖、多组氨酸新型细胞凋亡抑制剂、植物提取物、精浆、胆固醇均会提高精子的冻后活力、精子顶体和质膜完整性［48-51］。（7）其他。有学者利用高压均质的方法生产卵黄粉［52］，它可有效减少卵黄中的杂质，此种方法可能提升了精子冻后质量。生产的卵黄粉可以省去技术人员配制冻精试剂过程中剥鸡蛋的步骤，只需取卵黄粉进行溶解，方便一线人员配制冷冻保护液。纳米技术同样也值得关注［53］。已有学者利用纳米技术进行精子冷冻试验［54-55］，虽然试验结果不尽人意，但是这些新方法值得深入研究、完善，相信在未来随着科学技术的发展，越来越多的新方法将会应用到猪冻精生产上来，届时猪冻精技术将会越来越完善，冻精质量会越来越高。

3 猪冷冻精子的应用

3.1 精子受精的基本原理

精子在向受精部位运动的过程中会出现阻碍精子前进的因素，只有了解这些因素才能有效实施低剂量子宫内深部输精。阻碍精子到达受精部位的主要原因是以下两点：（1）重力作用造成精子回流。一般采用普通输精方法25%～45%的精子会回流浪费［56-57］。（2）母体对精子进行选择。这种选择包括非特异性选择和特异性两种。非特异选择过程主要出现在受精后0～15 min，特异性选择会在之后的45 min内选择活力较强的精子进行受精［46］。在精子到达输卵管峡部之前，会受到子宫颈褶皱及输卵管绒毛的物理阻碍，从而丢失了一部分精子。采用普通方法进行人工授精大概会消耗80～100 mL含有15亿～40亿个精子的精液［58］。国外曾有学者对自然交配和普通人工授精到达子宫与输卵管交界处、输卵管峡部的精子数做过统计，结果表明，到达子宫输卵管交界处的精子为（1～3）×105个，而到达输卵管峡部的精子仅为（1～3）×103个［59］。大部分精子在到达受精部位之前都被淘汰了，这是一种极大的浪费。有研究者指出，采用低剂量精液进行子宫内深部输精技术可以减少50%的回流精液量［60］，所需的精子数更少。精液冷冻是一种用于保存具有高遗传力和优良性状种公猪遗传信息的方法，利用低剂量精子进行子宫内深部输精就显得尤为重要。

3.2 猪冷冻精液低剂量深部输精

20世纪50年代，英国瑞丁人工授精中心做的关于牛冻精的人工授精试验中，首次将人工授精技术与精液冷冻保存技术结合应用。在此之后经过了70年的发展，使用猪冻精进行人工授精占人工授精的比例仍很小，只有1%左右［30］。其原因是大多数冻精解冻后活力只有50%～60%，其活力远低于鲜精［61-62］。随着人工授精技术的发展，尤其是低剂量子宫内深部输精技术的发展，冷冻精液的授精成功率得到了相应的改善［62-63］。采用低剂量子宫内深部输精技术，仅使用较少的输精剂量就可以实现与普通人工受精同样的授精效果；能使精子直接深入子宫角、子宫体、子宫与输卵管交界处，避免母体阴道、子宫颈等部位对精子的选择作用，使更多的精子能到达受精部位。因此，采用低剂量子宫内深部输精技术时使用少量的精子便可使同样数量的卵母细胞受精，保证了产仔率。也因此，低剂量深部输精技术对于较为珍贵的冻精使用就显得非常重要。尤其是非洲猪瘟在我国流行的大背景下，活体引种已不再安全，使用低剂量精子进行子宫内深部输精，成为了一个很好的选择。冻精低剂量子宫内深部输精技术能够做到安全引种，降低生物安全风险，并兼顾繁殖效益。现今的输精方式正在朝着减少一次输精的精子数量、体积，以期获得更好的经济效益的方向发展。这使得深部输精技术越来越受到欢迎。深部输精相比较于传统的输精方式对精子的利用率显著提升［64-65］。普通人工授精一个授精剂量需要精子约30亿个，应用于冻精输精中是一种极大的浪费。有研究者采用低剂量子宫内深部输精输卵管微创手术的方法进行输精，把每条输精管所需要的有效精子数减少到了3×105个［66］。相信在未来随着子宫内深部输精技术的完善每次输精所需要精子数量会越来越少，深部输精与冻精技术的结合会大大方便远距离跨地域的引种工作、稀有猪种保种工作。

根据输入精液部位不同，低剂量子宫内深部输精可分为输卵管输精法（intra-oviductal insemination，IOI）、子宫角输精法（deep uterine insemination，DUI）和子宫颈后人工输精法（post-cenrical insemination，PCI）。PCI法又称子宫体（宫腔）输精法（intrauterine insemination，IUI）。IOI主要指借助腹腔镜设备，并采用微创手术的方法，将精液直接输送到子宫输卵管结合部位，其输精数较少，只需要3万～6万个精子即可满足授精需要。DUI主要利用长1.8 m的输精管将精液输送到子宫角处，一次授精所需要的鲜精精子数与普通人工授精方式相比，将减少至原来的5.0%，需要100万～200万个精子；利用冻精进行人工授精，所需冻精精子数减少至原来普通人工授精的16.7%。PCI指利用输精工具使精液穿越母猪子宫颈直接到达子宫颈后15～20 cm处子宫腔内，其一次授精需要10亿个精子左右。目前，IOI由于操作复杂主要应用于科研，而PCI在实际生产中的应用最为广泛。但是当使用比较珍贵的精液进行输精时IOI、IUI能够有效减少一次授精所需要的精子数，这时使用IOI、IUI进行人工授精是一个不错的选择。

实际生产中常通过以下方式提高人工授精的效率：（1）在精液中添加相应成分提高人工授精效率。有研究人员指出，精清可以减少子宫对精液的免疫，从而增加人工授精效率。研究者向精液中添加咖啡因、利钠肽前体等来提高精子活力，从而提高人工授精效率。（2）加强人工授精技术人员的培训。配种技术人员将输精管准确插入母猪子宫颈深处能有效提高授精成功率，而初产母猪的深部输精对技术要求更高。有研究人员做过统计，输精管穿过初产母猪子宫颈的成功率只有86%［67］，远低于经产母猪成功率（95%）［68］。随着操作人员熟练度的提升，人工授精成功率也会有相应的提高。（3）授精次数和时间的优化。母猪不同个体的持续发情时间是不一样的，一般是1～4 d；发情后开始排卵的时间也不相同，一般在24～36 h之间［69］。授精时间和排卵时间之间存在着较强的相关性，排卵时间与授精时间间隔0～24 h内进行授精的成功率是最高的。有的饲养人员喜欢采取两次授精的方法，即检测到发情后立即进行第一次授精，6～12 h后进行第二次授精［70］，这种方法相比较于一次授精更为可靠。

4 猪性控精液的冷冻保存

4.1 性控精液概念与现状

随着精液冷冻保存技术和低剂量深部输精技术的逐渐成熟，为猪性控精液的冷冻保存及其应用提供了技术支持。性控精液是采用一定的人工手段筛选出X或Y精子，用于繁殖特定性别后代的一项技术。1991年世界上第一头利用流式细胞术筛选性控精液授精的猪出生，距今已有20多年的历史［71］。直到现在性控精液的生产依旧依赖于流式细胞术［72］。但利用流式细胞术分选精子价格昂贵，并不适用于中小型养猪企业［73］。据报道，猪精子对环境变化非常敏感，在经过流式细胞仪分选的过程中，染色和荧光照射的过程会对猪精子造成损伤［74］。

综上所述，猪的性控精液技术真正应用于生产尚需时日。众所周知，性控精液的应用离不开精子的超低温冷冻保存技术，这是由于分选精子所需的时间较长，分选场所往往距离输精地点又比较远，分选后精子往往需要冷冻保存。

4.2 性控精液的应用

性控精液在奶牛的生产中已经广泛应用，但是在养猪业中并不多见。一方面是由于利用流式细胞术等方法分选出猪一次授精剂量的精液成本较高，难以推广；另一方面养猪业从业者还未普遍认识到性控精液所带来的长效收益。应用性控精液能够加快遗传改良进程并能预选雌性家畜，因此性控精液的应用将给养猪业带来巨大收益。目前随着深部输精技术的发展，尤其输卵管输精技术的成熟，每次授精所需的精液量已经大大减少，每条输卵管只需要3×105个有效精子［71］。相信性控精液技术与猪子宫深部输精技术的结合应用将成为养猪业的热点，猪性控精液的商业化应用也会在不久的将来得到实现。

5 展望

随着越来越多冷冻保护剂被发现、分离死精技术的完善、抗氧化物质的添加等新技术的应用，猪冻精制作技术在逐渐成熟，冻精的质量也将逐步提高。冻精的制作成本会更加低廉，冷冻精液的质量必将进一步提升，结合猪人工授精技术的发展尤其猪深部输精技术的发展和完善，未来引种和保种工作中使用冻精将成为常态。未来猪冷冻精液的应用前景必定更加广泛。猪性控精液、猪冷冻精液和人工授精技术的结合应用将会在未来大型种公猪站中实现常态化，企业可以根据客户的要求定制不同性别的精液，并实现全国性长距离的服务，帮助养猪企业获得更大的经济效益。