芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中挥发性香气物质的变化

王 丽，李 雪，刘光宪, ，程文龙，张 耀，王国庆，茅赛赛

（1.江西省农业科学院农产品加工研究所，江西南昌 330200；2.国家红壤改良工程技术研究中心，江西南昌 330200；3.吉安井冈农业生物科技有限公司，江西吉安 343099；4.拓诚农业科技有限公司，江西兴国 360732）

芦笋具有较高的营养和药用价值，被誉为“蔬菜之王”[1]。在我国，芦笋主要以鲜销为主，精深加工比例较小。近年来，随着加工技术水平的提升，芦笋加工从传统食品向营养保健食品转型升级。加工产品由传统的酸味芦笋罐头[2]、芦笋混合发酵酒[3]、芦笋茶[4]、芦笋面条等向芦笋黑米酒[5]、芦笋酸乳[6]、芦笋发酵香肠[7]等多种新型产品转变。在芦笋产业发展中，除了应重视丰富加工产品种类外，还需为副产物的综合利用寻找新的出路。在芦笋采收、加工过程中，产生的小笋、切断笋、芦笋老茎等副产物产量较大。这些副产物含有丰富的游离氨基酸[8]、皂苷类化合物[9−10]、多糖[11−12]等，并具抗癌、提高免疫力、降血糖血脂、抗衰老和抗疲劳等功效[13−14]。

当前，部分学者开展了以可食用部分芦笋为主的皂苷类化合物、多糖等功能性成分的提取与优化[10,12,15]研究工作，而芦笋副产物的加工及高值化利用研究较少，副产物基本上被丢弃，综合利用率不高，从而导致资源浪费及严重的环境污染[16]。因此，深入研究与开发芦笋副产物资源显得尤为重要。

果酒中的挥发性风味物质对其品质有着重要影响，目前针对果酒的研究主要集中在单一的水果或者两种水果混合发酵工艺研究及其挥发性成分分析，而对芦笋果酒发酵研究近乎空白。为了提高芦笋副产物资源的综合利用率，延长芦笋产业链，本研究以芦笋副产物和猕猴桃为原料，酵母发酵酿制芦笋猕猴桃复合果酒，对其发酵过程中挥发性风味物质进行分析鉴定及变化规律研究，并探索出不同发酵阶段特征香气物质的差异性，旨在为芦笋猕猴桃复合果酒的开发提供理论参考，为芦笋副产物的精深加工提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦笋副产物 南昌禄祺实业有限公司；江山徐香猕猴桃 购于南昌华润万家澄湖店；高活性酿酒酵母 安琪酵母股份有限公司；果胶酶（40000 U/g）食品级，厦门墨奕怀食品有限公司；焦亚硫酸钾 食品级，烟台帝伯仕自酿机有限公司；水溶性壳聚糖食品级，浙江一诺生物科技有限公司；苯乙酸异戊酯色谱纯，Sigma 公司。

7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪 美国Agilent 公司；57330-U 固相微萃取装置、50/30 μm 57348-U 固相微萃取针 美国Supelco 公司；08-2T 恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦笋猕猴桃复合果酒制作工艺

1.2.2 工艺操作要点 芦笋、猕猴桃混合原汁制备：猕猴桃含有大量的抗氧化物质，在发酵过程起到一定的护色作用，且猕猴桃果汁和芦笋汁两者颜色较为相近，混合发酵后对芦笋猕猴桃复合果酒的颜色影响较小。为此，本文以新鲜的小笋、切断笋、老茎等芦笋副产物和猕猴桃为原料，分别清洗干净，沥干水分，芦笋副产物用螺旋高速压榨机进行压榨，猕猴桃去皮切分后用料理机破碎榨汁，按照芦笋汁:猕猴桃汁=3:1 比例混合，加入100 mg/L 焦亚硫酸钾和0.2‰果胶酶酶解2 h，并装入灭菌的5 L 玻璃泡菜坛内。

调整成分：参考丁立孝等[17]方法，将芦笋、猕猴桃混合原汁的糖度用白砂糖调整至22%，pH 用柠檬酸调至4.5。

主发酵：在发酵体系中添加0.04%活化后的酵母，水封，在25～28 ℃下发酵，隔天搅拌1 次。当无气体产生，可溶性固形物含量基本不变且用比重计测量读数小于1.0 时，表示主发酵结束[18]，发酵时间为7 d。

后发酵：采用虹吸法将主发酵结束后的上层酒液转入另一个灭菌的玻璃泡菜坛内，水封，15 ℃静置发酵8 d。

陈酿：在后发酵结束后的酒液中添加1.5 g/L 的壳聚糖进行澄清48 h。采用虹吸法将上层酒液转入另一个灭菌的2.5 L 自动排气密封罐，5 ℃存放15 d。

1.2.3 挥发性香味物质SPME-GC-MS 分析

1.2.3.1 样品制备 取10 mL 样品置于20 mL 萃取瓶中，加入20 μL 5 mg/mL 的苯乙酸异戊酯作内标，密封，置于60 ℃水浴中，磁力搅拌速度500 r/min，平衡20 min 后，将活化后的萃取头插入样品顶空部分，萃取30 min，于250 ℃解吸5 min 后进行GC-MS数据采集与检测。

1.2.3.2 GC-MS 条件 GC 条件：进样口温度250 ℃，气质接口温度250 ℃，载气流速1.5 mL/min。升温程序：初始温度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升温到100 ℃保持2 min 后；以4 ℃/min 升温到140 ℃保持1 min 后；以4 ℃/min 升温到180 ℃保持2 min后；以5 ℃/min 升温到250 ℃保持5 min。

MS 条件：EI 源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离能量70 eV，扫描范围35～550 Da。

1.2.3.3 定性定量方法 将样品中挥发性香味物质的测定结果与WILEY8.0 和NIST2014 中的谱库进行对比分析，仅保留正反匹配度大于80%的物质（最大的匹配度为100%）。以5 mg/mL 苯乙酸异戊酯为内标物对样品中挥发性香味物质进行定量分析，计算公式如下：

式中：Cx和Ax分别为待测挥发性化合物的浓度（μg/L）和峰面积，m 和A 分别为加入内标物的质量（μg）和峰面积，V 为样品的体积（L）。

1.2.3.4 主体挥发性香味物质的OAV 分析 通过OAV 对不同发酵阶段芦笋猕猴桃复合果酒的主体挥发性香味物质进行分析与评价，计算公式如下：

式中：Ci为某种挥发性香味物质的含量（μg/L）；OTi为该化合物的嗅觉阈值（μg/L）。

1.3 数据处理

采用 SPSS 18.0 和Excel 2010 软件进行试验数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段芦笋猕猴桃复合果酒中挥发性香气物质分析

采用SPEM-GC-MS 技术对芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中挥发性香味物质进行分析鉴定，由表1 可知，共检测出78 种挥发性香气物质，包括37 种酯类、20 种羰基类、12 种醇类、5 种烷烃类、2 种酚类、1 种萜烯类和1 种酸类。

表1 芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中挥发性香气成分及含量Table 1 Volatile aroma components and content of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

续表1

续表1

由表2 可知，发酵前期（1 d）、发酵中期（4 d）、发酵后期（7 d）、后发酵（15 d）、陈酿期（30 d）样品中分别检测出51、38、24、21 和26 种挥发性香味物质，总质量浓度分别为1882.559、11199.326、6786.553、4933.908、5712.280 μg/L。在芦笋猕猴桃复合果酒发酵期间，挥发性香气物质的种类是逐渐下降并趋于平稳的状态，质量浓度是呈先上升后下降并趋于平稳的状态。在整个发酵阶段中，含量较高的挥发性香气物质均为酯类和醇类，它们对芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中整体香气具有重大的贡献。该结果与有关猕猴桃酒挥发性香气物质的研究一致[20,25]。

表2 芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中挥发性香气物质的种类及含量Table 2 Volatile aroma types and content of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

2.1.1 各发酵阶段的芦笋猕猴桃复合果酒中酯类物质分析 酯类是构成发酵酒香气骨架的主要成分，也是作为评价发酵酒的重要指标之一，其主要来源于酿酒酵母的发酵产物及高级醇、脂肪酸在酶催化下发生酯化反应[26−27]；并能赋予水果和花香味，对增加酒体风味的多样性和愉悦性具有积极的作用[28]。在以红心火龙果[21]、猕猴桃[25]、葡萄[28]等为原料所酿造的果酒均体现出酯类对酒体风味的有着重要贡献。

结果显示，酯类是芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中种类最多的挥发性香味物质。在芦笋猕猴桃复合果酒发酵阶段的5 个样品中分别检测出20、27、15、13 和17 种酯类挥发性香味物质，总质量浓度分别为653.284、6781.996、2275.226、1546.319 μg/L 和2132.338 μg/L。酯类的含量变化呈先上升后下降并趋于平衡，这是由于酵母菌进入发酵后期之后，其活力变弱，因此与发酵中期相比，酒中的酯类含量有所下降[26]。由于芦笋猕猴桃复合果酒中乙醇含量较高，在其发酵过程中，乙酯含量在总酯中所占比例相对较大，分别为54.72%、79.20%、72.92%、76.60%、70.14%，乙酯含量占比呈现先上升后趋于稳定状态，这与酒中乙醇浓度随着发酵进行趋于平衡有关。

乙酸异戊酯、己酸乙酯、苯乙酸甲酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯和癸酸乙酯为整个发酵阶段中共有的酯类化合物。在发酵中期，癸酸乙酯（1658.164 μg/L）、辛酸乙酯（1429.724 μg/L）、乙酸异戊酯（1150.851 μg/L）和己酸乙酯（516.763 μg/L）的含量均高于其它发酵阶段；在发酵前期，苯乙酸乙酯（87.149 μg/L）和苯乙酸甲酯（47.439 μg/L）的含量均高于其它发酵阶段，并呈现逐渐下降并趋于稳定的状态。在发酵前期，主要的酯类是二氢茉莉酮酸甲酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，含量最高的为二氢茉莉酮酸甲酯（132.332 μg/L），但在其它发酵阶段均未检测出该物质。在发酵中期、发酵后期、后发酵和陈酿期主要的酯类均为癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯及乙酸乙酯，这些酯类化合物赋予了芦笋猕猴桃复合果酒果香、花香及甜香[21]。其中，陈酿期中乙酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯的含量高于后发酵期。

2.1.2 各发酵阶段的芦笋猕猴桃复合果酒中醇类物质分析 醇类是酯类化合物的前驱物质，是赋予发酵酒醇甜和香味的主要来源之一[29]，其种类仅次于酯类。醇类化合物一方面是酵母通过糖分解代谢或脱羧反应而形成的代谢产物，另一方面是芦笋原料中蛋白质分解或微生物菌体蛋白水解成氨基酸，在发酵过程中，氨基酸发生脱氨、脱羧反应，并降解成各种醇类[30]。在芦笋猕猴桃复合果酒发酵阶段的5 个样品中分别检测出8、6、6、6 和6 种醇类挥发性香味物质，总质量浓度分别为670.321、4239.800、4312.885、3334.979 和3536.846 μg/L，醇类的含量变化呈现先上升后下降并趋于平衡的状态。

异戊醇、异丁醇和苯乙醇为整个发酵阶段中共有的醇类化合物。在发酵后期，异戊醇（3357.138 μg/L）和异丁醇（497.657 μg/L）的含量最高。在各发酵阶段含量最高醇类均为异戊醇，其属于高级醇是杂醇油的主要成分，也是葡萄酒中重要的风味物质[31]，具有苹果白兰地香味和草香味[32]，在整个发酵过程中呈现先上升后下降并趋于稳定状态。异丁醇是一种具有酒精味和指甲油味的高级醇，其变化规律与异戊醇类似。在芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中的苯乙基类物质主要为苯乙醇，在发酵中期含量最高（573.196 μg/L），它是莽草酸的衍生物，赋予酒浓郁的蔷薇香、玫瑰花香、茉莉花香等多种花香和果香[33]。有相关报道显示：异戊醇和苯乙醇是樱桃果酒[20,25]和猕猴桃果酒[34]主要醇类物质。2,3-丁二醇在发酵前期未检测到，其中发酵中期的含量最高（628.089 μg/L），呈现先下降后缓慢上升的趋势，陈酿期的含量高于发酵后期和后发酵期。2,3-丁二醇具有黄油和奶油味，但阈值较大，对风味影响较小[19]。

2.1.3 各发酵阶段的芦笋猕猴桃复合果酒中其它香味物质分析 酸类化合物属于酵母发酵的次级代谢产物，可与醇类化合物反应生成酯类，因其阈值较高，对酒的风味贡献起到助香、协调和平衡的辅助作用[22]。结果显示，仅在芦笋猕猴桃复合果酒的发酵中期检测到104.267 μg/L 的乙酸，乙酸在低浓度时具有浓郁的、令人愉快的醋香味，对酒的口感及风味有较好的修饰作用。在其它发酵阶段均未检测到酸类化合物。

羰基类化合物可通过醇类氧化形成，但多数是微生物发酵的代谢产物之一，其赋予酒水果香味。结果显示，在发酵前期、发酵中期及发酵后期分别检测到19、2 和1 种羰基类化合物，总质量浓度分别为484.644、15.927 和154.173 μg/L。羰基类化合物主要产生于发酵前期，可能是由于前期微生物代谢活跃，产生的种类及量较多。但这类物质的化学性质较为活泼，是一种不稳定的中间化合物，会在发酵过程中进一步发生氧化形成羧酸类化合物，使其含量降低[35]。为此，在后发酵及陈酿期均未检测到羰基类化合物。己醛是具有生青味的物质，仅在发酵前期中检测出，且是发酵前期含量（125.797 μg/L）最高的羰基类化合物。有研究表明己醛是红心火龙果汁中特征香气物质，但其酿制的果酒中并未含有该种化合物[21]。

较高浓度的苯酚类化合物能赋予酒类似药味的香气[36]。在芦笋猕猴桃复合果酒发酵阶段的5 个样品中共检测出2 种苯酚类物质，在整个发酵阶段均检测到2,4-二叔丁基苯酚，其具有浓郁的果香味，在发酵前期含量最高（44.221 μg/L）。此外，2,6-二叔丁基对甲酚仅存在于陈酿期。在整个发酵阶段检测到2 种烷烃类化合物，其中环庚烷仅在发酵前期存在，而柠檬烯存在于整个发酵阶段，其具有浓郁的柠檬和花香味，在发酵前期含量最高（22.741 μg/L）。虽然苯酚类和烷烃类化合物的种类和含量均较低，阈值较高，对风味贡献较低，但它们具有较为明显的香气特征，对芦笋猕猴桃复合果酒的主体香气具有一定的修饰作用。

萜烯类化合物通常是以糖苷的形式存在于果肉中，在微生物发酵过程中，经酶解作用下释放出来，形成游离状态且具有挥发性的风味物质。该类化合物阈值较低，且具有水果和花香味，即使在低浓度下对酒的风味仍有着较大贡献[37]。本实验中仅在发酵前期检测出桉叶油醇（3.566 μg/L），该物质赋予芦笋猕猴桃复合果酒水果甜香味及薄荷香气。有研究显示，桉叶油醇普遍存在于猕猴桃果酒中[20,25]。

2.2 各发酵阶段的芦笋猕猴桃复合果酒特征香气分析

酒的主体风味、香气感官贡献率与各挥发性香气物质的浓度及其阈值密切相关，为进一步了解芦笋猕猴桃复合果酒发酵各阶段中主体挥发性香气物质成分，采用OAV 法筛选出各发酵阶段的特征香气物质。OAV＞1 的香气化合物对酒的风味特征有贡献，且OAV 值越大，对风味特征贡献就越大；而OAV＜1 的香气化合物对酒整体风味起到一定的协调和修饰作用[38]。

由表3 可知，在芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中，共得到13 种特征香气物质，包括10 种酯类、2 种醛类和1 种萜烯类。5 个样品中分别检测出8、6、4、6 和8 种特征香气物质。己酸乙酯和辛酸乙酯为5 个样品中共有的特征香气物质，其中辛酸乙酯是在各发酵阶段中OAV 值最大的化合物，这些化合物属于中链脂肪酸乙酯，具有浓郁的果香和花香味，因阈值较低，使得OAV 值大，对酒的香气有着较大贡献，这说明果香和花香味是芦笋猕猴桃复合果酒的特征香气，这与Zhao 等[39]研究结论一致。其次，乙酸异戊酯和2-甲基丁基乙酸酯的OAV 较大，有研究表示[40]，这些化合物是野生猕猴桃酒的特征香气物质。其中，乙酸异戊酯是发酵中期、发酵后期、后发酵和陈酿期的特征香气物质；2-甲基丁基乙酸酯是发酵前期、后发酵和陈酿期的特征香气物质。己醛、苯乙醛和桉叶油醇仅在发酵前期检测出，也是发酵前期的主要特征香气成分，赋予花香、青草和薄荷香。2-甲基丁酸乙酯具有甜水果味，仅在发酵前期和陈酿期检测出，虽含量较低，但其阈值为1 μg/L，是发酵前期和陈酿期的特征香气物质。异戊酸乙酯仅在陈酿期检测出，属于陈酿期的特征香气物质，具有香蕉和甜水果味。癸酸乙酯属于中链脂肪酸乙酯，其阈值较高（200 μg/L），但其含量除在发酵前期含量较低外，其它阶段含量均较高，且OAV 值＞1，赋予一定的果香和脂肪味。因此，在芦笋猕猴桃复合果酒的不同发酵阶段的特征香气物质的成分存在一定的差异性。

表3 芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中特征香气成分OAV 分析Table 3 OAV analysis of aroma characteristics of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

3 结论

本文主要研究了芦笋猕猴桃复合果酒在发酵前期、发酵中期、发酵后期、后发酵、陈酿期中挥发性香味物质的变化规律。在发酵期间，共检测出78 种挥发性香气物质，其种类是逐渐下降并趋于平稳的状态，其质量浓度呈先上升后下降并趋于平稳的状态。各发酵阶段中含量较高的挥发性香气物质均为酯类和醇类，该类化合物对酒的整体香气具有重大贡献。

从OAV 法鉴定出13 种特征香气物质，主要为酯类化合物，其中整个发酵阶段中共有的特征香气物质为己酸乙酯和辛酸乙酯，赋予了芦笋猕猴桃复合果酒浓郁的果香和花香的特征香气。结果表明不同发酵阶段的特征香气物质成分存在一定的差异性，产生差异性的内在机理还需进一步研究。该研究一方面能为芦笋猕猴桃复合果酒的品质分析提供理论参考，另一方面也为芦笋副产物高值化综合利用提供新的途径。