基于网络药理学研究化橘红-蛹虫草复方止咳活性及作用机制

焦春伟，钟 静，黄海勇，梁慧嘉，郑娇吉，陈家明，谢意珍,

（1.广东粤微生物科技有限公司，广东肇庆 512000；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州 510525；3.广东南粤药业有限公司，广东广州 510530）

咳嗽是健康人体清除呼吸道异物和过量支气管分泌物的生理防御机制，在宿主防御中具有一定有益作用[1]。然而，持续性的咳嗽会导致机体衰弱，提高慢阻肺、哮喘及呼吸衰竭等疾病的发病率，严重影响患者身心健康和生活质量[2]。

化橘红，即化州橘红，是化州柚（Citrus grandisTomentosa）或柚（Citrus grandis（L.）Osbeck）的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，含柚皮素、芹黄素及橙皮苷等活性成分[3]。蛹虫草（Cordyceps militarisL.Link），又被称为北冬虫夏草，含虫草酸、虫草素等活性成分[4]。临床调查研究显示，多个止咳平喘中医验方中含化橘红与蛹虫草两种成分，其中化橘红在验方中发挥“化痰降气”功效；蛹虫草在验方中发挥“益肾”作用[5−7]。同时，药理试验研究表明化橘红具有治疗咳嗽、咳痰及流涕等活性[8]；蛹虫草具有抗炎、缓解气管敏感及降低咳嗽反射等活性[9]。咳痰与炎症是咳嗽的两大主要特征，化橘红与蛹虫草分别对两种特征具有缓解作用，截止目前，暂未见两种原料复配的功能和机制研究报道。

基于中药成分多、作用靶点多和作用途径复杂等特点，本研究利用网络药理学方法研究复方止咳的的物质基础和作用机制，为进一步开发化橘红-蛹虫草复方功能产品和保健食品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

化橘红水提物和蛹虫草水提物 均由广东粤微食用菌技术有限公司提供，两种水提物按1:1 的比例进行混合，实验时使用纯化水稀释至所需浓度；TNF-α、IL-1α和IL-1β的ELISA 检测试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；SPF 级健康成年昆明小鼠70 只，雌雄各半，体质量14～18 g 购自南方医科大学（许可证号：SCXK（粤）2016-0041），饲养于广东省微生物研究所动物中心，饲养环境条件为温度18～29 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 明暗交替，自由摄食和饮水。动物经适应性饲养1 周后开始实验。

402B 超声雾化器 江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；BS200S 分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；JJ1000 型电子天平 江苏常熟市双杰测试仪器厂；ML-1600 平板显微镜 武汉塞维尔生物技术有限公司；L535R 台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；Infinite M200 Pro 多功能酶标仪 瑞士Tecan 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠氨水引咳试验 参考谢伟娜等[10−11]研究对昆明小鼠进行引咳筛选试验，喷雾为浓氨水，喷雾时间2.5 min，测定小鼠10 min 内的咳嗽次数，剔除10 min 内咳嗽次数＜10 次的小鼠。将测试合格的48 只小鼠随机分成四组，每组12 只（雌雄各半），分别是空白对照组、模型组、复方低剂量组、高剂量组。本试验从生产运用角度出发，考虑产品加工工艺、市售片剂、粉剂规格、产品提取物含量等多个因素，并参考《保健食品检验与评价技术规范》，确定复方低剂量与高剂量分别为200 mg/kg/d 和400 mg/kg/d。各组小鼠每日按0.1 mL/10 g 体积进行灌胃给药，空白组和模型组小鼠灌胃纯水，复方低剂量组与复方高剂量组小鼠灌胃对应剂量的提取物溶液，每日灌胃1 次，连续给药7 d。在末次给药1 h 后，将小鼠放入引咳仪器中，按上法，喷雾2.5 min，测定小鼠10 min内的咳嗽次数。

1.2.2 血清指标检测 小鼠咳嗽试验检测结束后，对小鼠进行摘眼球取血。血样室温静置分层后，在设置为4 ℃，3000 r/min 的离心机中离心10 min，小心吸出上层血清。采用ELISA 试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-1α和IL-1β的含量。

1.2.3 活性成分及对应靶点收集 在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库中检索搜集化橘红的化学成分信息，筛选出OB≥20%和DL≥0.1 的化合物。在CNKI 与Web of Science 文献数据库中以化橘红和蛹虫草作为关键词进行搜索，查找与咳嗽相关药理作用的活性成分，汇总后得到复方的主要活性成分。随后在TCMSP 数据库中获得化橘红候选化合物对应的潜在靶标。在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取蛹虫草主要化学成分的SMILES 信息用于化合物的靶点预测。将候选化合物的SMILES 导入到Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）与 Pharm-Mapper（http://www.Lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库，物种选“Homosapiens”，收集并整理出“Probability”＞0 的潜在靶点。将获得的靶点名称导入到Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/），其中物种被选为“homo sapiens”，可将靶标名称进行格式转换，获得对应的Gene name。

1.2.4 咳嗽相关靶点收集 在Genecards（http://www.genecards.org/）数据库中以“cough”为关键词，检索获得咳嗽相关靶点。以相关性评分＞1.8 分作为筛选条件，获得与咳嗽相关性较高的疾病靶点。

1.2.5 “复方-靶点-咳嗽”网络构建 将咳嗽疾病靶点、化橘红-蛹虫草复方活性成分及其对应靶点导入Cytoscape 软件，构建“复方-靶点-咳嗽”网络，并对网络进行拓扑分析。

1.2.6 PPI 网络构建 绘制韦恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获得化橘红-蛹虫草复方治疗咳嗽的相关靶点。应用String 平台对筛选出的交集靶点构建蛋白作用网络。设置靶点间相互作用分值大于0.9，即得蛋白相互作用网络。然后将得到的蛋白网络导入Cytoscape3.6.0 软件中，根据得分值和节点度值设定对应节点和边的颜色和粗细大小进行调节。

1.2.7 GO 与KEGG 富集分析 运用Metascape 对复方与咳嗽交集靶点进行GO 与KEGG 富集分析，按P值大小排序，筛选P值最小的前10 条GO 条目与信号通路，用于绘制气泡图。

1.3 数据处理

采用SPSS 25.0 统计软件包进行数据分析，本文中的定量参数以均数±标准差（）的形式表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示组间差异显著，P＜0.01 表示组间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 化橘红-蛹虫草复方对咳嗽次数的影响

本试验构建了氨水引咳模型，通过测定给药前后10 min 内模型动物的咳嗽次数对比分析复方对咳嗽的改善作用。试验期间，空白组老鼠均未咳嗽，与模型组差异显著（P＜0.05）。由表1 可知，给药前10 min 内，三组小鼠咳嗽次数无显著性差异（P＞0.05）；而给药后，复方低、高剂量组小鼠的咳嗽次数较模型组均极显著下降（P均＜0.001），说明化橘红-蛹虫草复方低、高剂量组对氨水引起小鼠的咳嗽均有一定改善作用。已有研究表明，蛹虫草对慢性支气管炎具有良好治疗作用，能明显减轻患者咳嗽、咳痰及喘息等不良症状[12−13]。此外，侯秀娟等[14]研究发现化橘红提取物能明显延长浓氨水刺激引起的咳嗽潜伏期，减少2 min 内的咳嗽次数。以上结果与本研究结果相似，说明本复方能够一定程度减少咳嗽次数。

表1 化橘红-蛹虫草复方对小鼠咳嗽次数的影响（n=10）Table 1 The effect of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound on the number of cough in mice (n=10)

2.2 对小鼠血清炎症因子水平的影响

由图1 的ELISA 测定结果可知，与空白组对比，模型组小鼠的TNF-α、IL-1α和IL-1β水平均显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，复方低剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1α及IL-1β水平均降低；复方高剂量组小鼠血清TNF-α与IL-1β水平显著降低（P＜0.05），IL-1α水平极显著降低（P＜0.01）。炎症是咳嗽的重要病理特征之一，其产生会导致气道狭窄，呼吸功能低下，诱发咳嗽[15]。因此，植物提取物的抗炎活性对咳嗽的缓解具有一定的促进作用[16−17]。王春燕等[18]，王红霞等[19]研究显示，咳嗽小鼠血清炎症因子水平显著高于健康小鼠，补充百合、生地黄、沙参等复方提取物或柚皮素等天然成分后，炎症因子水平明显降低，同时咳嗽得到缓解。上述结果表明，化橘红-蛹虫草复方对咳嗽模型小鼠血清炎症因子水平升高现象具有一定抑制作用。

图1 化橘红-蛹虫草复方对小鼠血清炎症因子水平的影响（n=10）Fig.1 The effect of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound on the levels of serum inflammatory factors in mice (n=10)

2.3 化橘红-蛹虫草复方活性成分与靶点筛选

在明确化橘红-蛹虫草复方具有一定止咳活性的基础上，运用网络药理学进一步研究该复方发挥止咳活性的作用机制。首先，运用多个在线数据库和现有文献收集复方的活性成分及其对应靶点。在TCMSP数据库与文献检索共收集到化橘红活性成分44 种，以OB≥20%和DL≥0.10 为筛选条件初筛后，获得化橘红活性成分17 种，除去3 种没有靶点的化合物，得到14 种化橘红活性成分。此外，柚皮苷做为化橘红的主要组成成分，虽然其OB 值和DL 值不满足筛选条件，但已有文献报道证明柚皮苷具有止咳作用，故直接将其纳入分析，最终共获得15 种化橘红活性成分，对应靶点139 个。通过文献检索确定蛹虫草的有效成分为虫草素和虫草酸，从Swiss Target Prediction 和PharmMapper 数据库中筛选得到83 个虫草素靶标和88 个虫草酸靶标。具体结果如表2所述。

表2 化橘红-蛹虫草复方活性成分与靶点信息Table 2 Active compositions and potential targets of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound

2.4 化橘红-蛹虫草治疗咳嗽潜在靶点分析

通过Genecards 数据库共获得699 个咳嗽相关靶点。Venn 图显示（如图2），将咳嗽对应靶点与化橘红-蛹虫草活性成分对应的265 个靶点取交集后，共获得78 个交集靶点，提示复方对咳嗽的治疗作用与其对78 个交集靶点的调控有关。

图2 化橘红-蛹虫草复方靶点与咳嗽相关靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound targets and cough related targets

2.5 “复方-靶点-咳嗽”网络分析

运用Cytoscape 软件构建“复方-靶点-咳嗽”网络，建立活性成分、潜在靶点及疾病三者之间的联系。结果如图3 所示，其中黄色节点代表活性成分，绿色节点代表疾病靶点，共包括95 个节点（17 个活性成分节点，78 个疾病节点）和164 条边。从活性成分角度分析（如表3 所述），通过Degree、Betweenness Centrality 及Closeness Centrality 值排序，发现排名前5 的活性成分为虫草酸（D-Mannitol）、虫草素（Cordycepin）、芹菜素（Apigenin）、β-谷甾醇（Betasitosterol）、柚皮素（Naringenin）。从靶点角度分析，排名前4 的靶点为PTGS2、PTGS1、SCN5A 及ADRB2，分别与15、13、11、8 种化合物发生相互作用。“复方-靶点-咳嗽”网络中有17 种有效成分作用于78 个靶点，说明复方治疗咳嗽具有多成分、多靶点的作用特点。柚皮素的止咳活性已被多篇研究报道，该成分能显著延长枸橼酸引咳豚鼠的咳嗽潜伏期，并能显著减少豚鼠咳嗽次数[20−21]，其作用机制可能与该成分通过抑制NF-κB 活性与抑制CD4 T 细胞产生Th2 细胞因子两种途径，来减轻气道炎症因子与粘液产生有关[22−23]。虫草素、芹菜素及β-谷甾醇三种物质未被证明其对咳嗽次数具有直接抑制作用，但这三种成分能有效调节炎症因子与细胞因子水平，缓解气道炎症[24−26]。这对后期开展天然成分止咳活性研究提供了理论参考。

表3 “复方-靶点-咳嗽”网络拓扑分析Table 3 Network topology analysis of “Compound-targets-cough”

图3 “复方-靶点-咳嗽”网络图Fig.3 Network of “Compound-targets-cough”

2.6 PPI 网络分析

蛋白质交互作用网络（Protein-protein interaction network，PPI）是以蛋白质为节点，不同蛋白间的交互作用为边所构成的网络，对分析蛋白质功能和关系具有重要意义[27]。本研究中，将得到的78 个交集靶点上传至String 数据库，物种选择“Homo sapiens”构建PPI 网络（设置最低交互作用得分为0.90，隐藏网络中独立的节点）。将得到的蛋白交互作用网络图导入Cytoscape 软件进行可视化处理后得到图4。图中节点大小与颜色深浅代表节点度值，即节点越大，颜色越深，则节点对应的degree 值越大。分析结果显示，该网络的平均节点度值为7.75，聚类系数为0.52。交互网络中degree 值排名前5 的靶点分别是JUN、IL6、MAPK3、TNF 和MAPK1，提示这几个靶点是交集靶点相互作用网络中的核心靶点。JUN 是炎症基因的主要激活剂，能够直接影响IL-1β、IL-6 及TNF-α等细胞因子的表达[28]，大量的细胞因子，会激活MAPKs，引起气道与肺部炎症。TNF 是在炎症大鼠模型体内早期表达的炎症细胞因子，而IL6 可能对炎症的进一步发展有促进作用[29]。

图4 PPI 网络图Fig.4 PPI network diagram

2.7 GO 与KEGG 富集分析

运用Metascape 对交集靶点进行KEGG 与GO富集分析，核心过程如图5 所述。GO 富集分析结果显示，化橘红-蛹虫草复方治疗咳嗽共涉及575个GO 条目，包括生物学过程（biological processes，BP）424 条，分子功能（molecular function，MF）89 条及细胞组成（cellular component，CC）62 条，核心条目包括对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）及细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）等。KEGG 富集分析结果显示，该复方治疗咳嗽共涉及272 条信号通路，核心信号通路包括IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）及TNF 信号传导途径（TNF signaling pathway）及AGE-RAGE 糖尿病并发症途径（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。临床调查研究显示，慢性气道炎症患者中存在IL-17 信号通路基因表达异常现象，该通路能够通过促进气道平滑肌收缩驱动气道高反应性，促进中性粒细胞引发肺部炎症，对多种炎症性疾病都存在广泛的影响[30]。TNF 信号通路由多种诱导细胞内信号通路的细胞因子组成，能够直接影响机体炎症、免疫、细胞凋亡及存活等[31]。AGE-RAGE 糖尿病并发症途径由机体中晚期糖基化终末产物与其受体RAGE 相互作用而激活，引起多种细胞内信号通路激活，如包括NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs，然后导致NF-κB 活性[32]。NF-κB 能够促进多种促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6 及TNF-α的表达，从而诱发机体炎症[33]。KEGG 富集分析结果显示，化橘红-蛹虫草复方治疗咳嗽作用机制中涉及对多条炎症相关信号通路的调控，说明该复方的止咳活性可能与其通过多种途径改善机体炎症相关。

图5 KEGG 与GO 富集分析核心生物过程Fig.5 KEGG and GO enrichment analysis of core biological processes

3 结论

本研究结果表明，化橘红-蛹虫草复方能显著减少引咳模型小鼠咳嗽次数，调节机体炎症因子水平异常，展现出良好的止咳活性。在此基础上，通过网络药理学对其止咳作用机制进行分析发现，化橘红-蛹虫草复方的止咳活性源于多种活性成分对多靶点、多通路综合作用的结果，其中虫草酸、虫草素、芹菜素、β-谷甾醇及柚皮素是其重要的物质基础。该结论为化橘红-蛹虫草复方止咳作用机制研究提供了一定的理论依据，后续可继续开展相关试验对活性成分、核心靶点及通路进行验证，以揭示该复方止咳的分子机制，推动相关保健食品的研发。