基于“异病同治”理论的宁泌泰胶囊治疗慢性前列腺炎和良性前列腺增生症的网络药理学研究*

赵 丰 邓楹君 陈亚洲 高庆和 郭 俊 王 浩 任 凯 郭 军

中国中医科学院西苑医院男科（北京 100091）

“异病同治”[1]指在中医学上不同的疾病在其发生和发展过程中出现了相同病机，从而采用同样方法加以治疗的法则，是中医学辨证论治的精髓之一，被广泛用于临床诊疗中。“异病”的基础是病机相同，湿热下注是泌尿系疾病的主要证型之一，以小便频数、淋漓涩痛、尿液混浊、尿道滴白、会阴胀痛、大便粘滞，舌红苔黄腻，脉滑数等为主要表现。慢性前列腺炎症（chronic prostatitis，CP）和良性前列腺增生症（Benign Prostate Hyperplasia，BPH）同为泌尿男科的常见病，根据多项流行病学统计显示，湿热下注证是CP和BPH的主要证型之一[2-5]。

“同治”是治法相同，以方类证就是“异病同治”的体现。宁泌泰胶囊是由贵阳新天药业股份有限公司生产的专利苗药，临床应用多年，广泛应用于慢性前列腺炎、良性前列腺增生症、尿路感染等中医辨证为湿热下注证的泌尿生殖系统疾病[6-7]。近年来在中药治疗CP领域，围绕宁泌泰展开的研究已成为热点[8]。宁泌泰对湿热下注证CP和BPH具有显著优势，是中医理论“异病同治”的体现，但宁泌泰治疗二者的具体作用机制目前尚不明确。本研究利用网络药理学方法，对宁泌泰胶囊的药物成分、靶点的相互作用关系和潜在通路进行研究，预测其治疗CP和BPH的相关机制，为后续宁泌泰胶囊对CP与BPH的治疗以及宁泌泰胶囊的进一步研究提供参考。

材料与方法

一、宁泌泰胶囊活性成分和靶点的收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[9]和中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMANTCM）检索宁泌泰胶囊组成药物（四季红、大风藤、白茅根、连翘、三颗针、仙鹤草、木芙蓉叶）。设置TCMSP的检索条件为药物口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18，将BATMAN-TCM中检索到的活性成分输入TCMSP中以同样检索条件进行筛选。同时检索相关文献，将文献中明确报道的但未在二者数据库中检索到或未达到OB、DL要求的活性成分也纳入本研究。在TCMSP中得到每个成分的作用靶点，通过Uniprot数据库将名称规范化并去重。

二、疾病靶点的收集和共有靶点的获取

以“chronic prostatitis”和“Benign Prostate Hyperplasia”为关键词，在GeneCards[10]、OMIM[11]和Disgenet[12]数据库搜索相关疾病靶点，其中在GeneCards数据库以相关性评分（Relevance score）的中位数为卡值，去重后获得与CP和BPH的疾病靶点。利用维恩图制作工具将三者的靶点进行交集处理，获得的结果即为宁泌泰治疗CP和BPH的共同有效靶点。将上述数据导入Cytoscape[13]中进行“中药-成分-靶点-疾病”互作可视化网络绘制，并获取该网络的拓扑数据。

三、蛋白互作（PPI）网络处理与核心靶点筛选

将共有靶点输入STRING数据库，限定物种为“人”进行PPI网络构建，取综合评分＞0.4分的结果，在Cytoscape软件中进行拓扑结构处理，以度值（Degree）、接近中心性（closeness centrality，CC）和介度中心性（Betweeness centrality，BC）等参数为卡值，筛选出宁泌泰治疗CP和BPH的核心靶点。

四、共有靶点的功能注释

将共有靶点输入metascape[14]数据库中，以“人”为限定物种，进行基因本体论（Gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以获得GO的生物过程（Biological Processes，BP）、分子功能（Molecular Functions，MF）、细胞组分（Cellular Components，CC）和KEGG通路，设定P≤0.01进行筛选和排序。

五、分子对接验证

利用PDB蛋白质数据库（http://www.Pdb.org/）下载PPI排名前3的核心靶点蛋白质晶体结构，在Pubchem数据库中下载Degree最高的3个活性成分的3D结构，将相关数据导入Autodock4.2.6软件，对活性成分和核心靶点进行分子对接验证。

结 果

一、宁泌泰胶囊活性成分和靶点

通过筛选及文献校对[15-17]，共纳入47个宁泌泰胶囊的活性成分，包括大风藤6个、白茅根4个、连翘18个、木芙蓉叶10个、三颗针6个、四季红11个、仙鹤草6个；对应靶点280个，其中来自大风藤58个、白茅根58个、连翘211个、木芙蓉叶189个、三颗针66个、四季红179个、仙鹤草172个，见表1。

表1 宁泌泰的活性成分相关信息

二、疾病靶点及共有靶点

研究共获得CP疾病靶点2259个，BPH疾病靶点2341个，将宁泌泰、CP、BPH三者靶点取交集如图2，最终获得1445个CP和BPH的共有靶点，占所有靶点总和的44.87%，这可能是CP和BPH“异病同治”的基础，获得168个宁泌泰治疗CP与BPH的共同有效靶点，占所有靶点总和的5.22%，见图1。

图1 宁泌泰活性成分与疾病靶点维恩图

三、宁泌泰“异病同治”治疗CP和BPH网络可视化

“中药-成分-靶点-疾病”互作关系网络图如图2，其中宁泌泰的七味药都具有较高节点度（degree）；所有活性成分的节点度都高于2，其中以槲皮素（MOL000098）、 山 奈 酚 （MOL000422）、β谷 甾 醇（MOL000358）、木犀草素（MOL000006）的节点度最高，均超过100；靶点中degree排名较靠前的有PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AA1、ADRB2、PPARG、TOP2A、ADRA1B、AR等。

图2 宁泌泰基于“异病同治”的“中药-成分-靶点-疾病”互作关系网络图

四、PPI及核心靶点筛选

PPI分析共得到797对综合评分≥0.9的蛋白互作数据，导入cytoscape软件中进行网络拓扑分析，分别以degree的二倍中位数和degree、BC、CC的中位数为卡值，获得一个包含10个节点，32条边的蛋白互作网络，这些节点即为宁泌泰“异病同治”治疗CP和BPH的核心靶点，筛选过程见图3，核心靶点及相关数据见表2。

表2 核心靶点

图3 核心靶点筛选过程

五、靶点的功能注释

将168个共有靶点导入metascape数据库中分别进行富集分析，选取P值≤0.01的结果。GO分析共得到248个BP条目，包括对无机物质的反应（response to inorganic substance）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、蛋白质磷酸化的正调控（positive regulation of protein phosphorylation）等，6个CC条目，包括膜筏（membrane raft）、囊泡腔（vesicle lumen）、蛋白激酶复合物（protein kinase complex）等；79个MF条目，包括转录因子结合（transcription factor binding）、激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等，根据P值大小（P≤0.01），用条形图分别绘制各类P值前10的条目（图4）。

图4 GO分析结果

KEGG富集分析共获得138条通路。根据P值（P≤0.01）筛选排序靠前的信号通路通路有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，以及PI3KAkt、IL-17、TNF、HIF-1、foxo等信号通路，主要与肿瘤、神经内分泌、免疫炎症以及缺氧应激等有关。而其后的VEGF，P53，PPAR信号通路则与血管内皮细胞，肿瘤细胞增殖、凋亡有关。对前20条信号通路以气泡图展示（见图5）。

图5 KEGG分析结果

六、分子对接

将排名前3的关键化合物和PPI中排名前3的核心靶点进行分子对接结果见表3。结合能（affinity）越小说明对接效果越好，affinity＜-7表示具有良好的结合性。

表3 分子对接结果

选择结合能最好的前组对接结果进行展示，见图6。图6（A）显示beta-sitosterol与SRC结合情况，图6（B）显示kaempferol与AKT1结合情况；图6（C）kaempferol与TP53结合情况。

图6 分子对接结果图示

讨 论

湿热下注证是CP和BPH的常见证型，湿为阴邪，其性重浊黏滞，易袭下焦；热为阳邪，易耗伤津液，二者合而为病，病程迁延不愈。湿热下注膀胱，则膀胱气化不利，可致尿频、尿浊、尿痛；精室以通为用，精室湿热，则见尿频尿急，小便短赤；湿热阻滞精道，引起精液粘稠不液化；湿热结于阴器，则阴部瘙痒或阴囊潮湿异味[18]。多项研究表明，宁泌泰可明显改善湿热下注证CP所引起的下尿路症状[19]，并可明显缓解疼痛，提高生活质量评分，安全有效[20-21]。在治疗BPH方面，临床研究显示在服用宁泌泰治疗后患者IPSS评分明显下降，Qmax明显提高[22]；在另一项研究中，宁泌泰对尿路刺激症状的缓解更明显，且在降低生活质量指数（QOL）评分方面比对照药物更优[23]。方中四季红清热利湿、利尿通淋、解毒散瘀，为君药；白茅根甘寒，清热利尿、凉血止血，大风藤利水消肿、祛风止痛，连翘清热凉血、活血解毒，三药合用，俱为臣药；三颗针清热、利湿、散瘀，仙鹤草收敛止血、解毒、补虚，佐助君臣，共为佐药；木芙蓉叶清热、解毒、消肿，助诸药以增效；全方清热解毒、利湿通淋、养阴止血，且利湿而不伤阴、驱邪而不伤正。适用于湿热下注型的CP和BPH患者[24-25]。

本研究筛选得到宁泌泰胶囊活性成分47个，靶点280个，CP疾病靶点2259个，BPH疾病靶点2341个，体现了宁泌泰治疗CP和BPH具有多成分、多靶点的特点。从图3可看出，宁泌泰组成的七味药都具有较高节点度，活性成分中槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、木犀草素的节点度最高，提示可能在治疗CP和BPH上发挥了更大的作用。槲皮素与山奈酚同属于天然黄酮类化合物，二者都具有良好的抗炎、抗氧化作用[26-27]。动物实验表明，槲皮素可改善Ⅲ型慢性前列腺炎模型大鼠的前列腺病理和痛觉敏感性，并可降低大鼠血清中NFκB及TNF-α水平以及前列腺组织中的COX-2蛋白水平，说明槲皮素可能通过降低炎性因子表达，抑制炎症反应来治疗CP[28]。山奈酚能够减弱促炎因子（如IL-6、IL-17A、TNF-α）的CD3+T细胞浸润及基因表达[29-30]。BPH方面，临床试验表明，使用槲皮素干预后，BPH患者AUA症状评分明显降低，并提升尿流率[31]。动物实验中，山奈酚表现出类似雄激素的活性，抑制双氢睾酮诱导的前列腺癌细胞（LNCaP）、人前列腺增生细胞（BPH-1）和人前列腺基质永生化细胞（WPMY-1）的雄激素受体转录活性、前列腺特异抗原（PSA）和雄激素受体（AR）基因表达以及细胞增殖；持续降低BPH大鼠前列腺指数，改善BPH大鼠的病理变化，使BPH大鼠血清中上调的T水平显著降低[32]。β-谷甾醇属植物甾醇，有降血脂、抗炎、抗肿瘤的作用。研究发现植物甾醇对维持男性前列腺健康的功能具有重要作用[33]。在一项治疗BPH的多中心研究中，发现β-谷甾醇治疗组的Boyarsky评分显著下降，最大尿流率提升，残余尿量减少[34]。

PPI网络结果显示，宁泌泰胶囊的活性成分主要通过 如 蛋 白 激 酶 相 关 受 体（AKT1、MAPK1、MAPK8、MAPK14）、炎症相关受体（TNF、IL-6、IL-1B、ALB）、生长因子相关受体（SRC、EGFR、KDR）、性激素受体（AR、ESR1）、癌症相关因子（TP53、FOS、CCND1）等核心靶点对于治疗CP和BPH发挥作用。AKT1调节巨噬细胞，包括促进抗炎性细胞因子的产生、吞噬、自噬并维持内稳态[35]。AKT1的过表达和前列腺体积的增大具有一定关联[36]。IL-6是主要的抗炎性细胞因子，能够抑制促炎因子的产生，研究报道CP患者的免疫应答中，IL-6诱导T、B细胞分化和增殖[37]。持续、顽固性炎症被认为在BPH发病和疾病进展中占主导地位，表现为多种细胞因子和生长因子的分泌，这些因子可促进前列腺细胞的生长[38]。IL-6等促炎症因子是BPH发病的重要因素之一，其所导致的慢性炎症反应对整个发病进程起到重要促进作用[39]。因此预测AKT1、IL-6是宁泌泰“异病同治”治疗CP和BPH的核心靶点。

目前公认的BPH主要发病机制主要集中于α-肾上腺素能受体诱导的自主神经过度活动和雄激素刺激前列腺组织细胞生长。AR可被雄激素激活，调控下游转录因子，从而引起前列腺的异常增殖；研究发现，BPH的前列腺组织中ERα、AR的蛋白及mRNA表达相比正常前列腺组织显著增高[40]，调节雌/雄激素的比例可影响前列腺基质细胞的增殖和凋亡。在PPI网络中，炎症相关因子TNF、IL-6、IL-1B等靶点具有较高度值，多项临床研究发现，应用宁泌泰治疗后，CP患者的不适症状减轻，并伴随前列腺液中TNF-α、IL-1β等指标显著下降[41-42]。根据研究结果，推测宁泌泰可能通过调节AR、ESR1、TNF、IL-1B等靶点分别治疗CP和BPH。

GO分析结果显示，宁泌泰胶囊可能通过对类固醇反应、氧化应激、激酶活性、凋亡信号通路和信号受体的调节来发挥治疗CP和BPH的作用。结合KEGG富集分析结果，PI3K-Akt信号通路可能是宁泌泰治疗CP和BPH的共同作用通路。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路可调节细胞的增殖、分化、凋亡等多种过程，动物实验表明，去势联合丙酸睾酮注射方法建立的BPH模型大鼠与正常大鼠相比，前列腺明显增生，PI3K/Akt/mTOR信号通路显著激活[43]；另一项动物实验发现，阻断PI3K/Akt信号通路可抑制前列腺的增生[44]；在BPH患者前列腺组织中，PI3K和AKT的基因表达水平随着前列腺体积的增加而增加[45]。PI3K/AKT信号通路还参与多种炎症反应和炎性疼痛的发生[46-47]，该通路激活后，其下游NF-κB信号通路活化，引起炎症反应[48]，在抑制PI3K/Akt信号通路及其上下游的释放后，可减轻炎症痛及神经病理性疼痛[49]。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族参与细胞的生长、分化、炎症反应等多种细胞生理病理过程，其家族中众多成员均与前列腺相关疾病有密切联系，如MAPK1、MAPK3在炎症反应中起着关键的作用[50]。使用MAPK抑制剂可减少促炎性细胞因子的合成及信号传导，从而治疗CP[51]。MAPK家族成员ERK1/2在BPH患者前列腺上皮和基质组织中呈高表达[52]。宁泌泰胶囊可能通过PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路对CP和BPH起到治疗作用。可能通过与抑制促炎细胞因子的合成、抑制信号转导、调节前列腺组织细胞生长、调节雄激素水平等机制来实现。

本研究通过网络药理学方法，在“异病同治”理念的指导下，筛选宁泌泰胶囊的活性成分及作用靶点，预测宁泌泰胶囊“异病同治”治疗CP和BPH的关键靶点与相关通路，体现了宁泌泰胶囊“多成分、多靶点、多途径”的特点，研究结果与当前相关领域内的研究成果基本一致，具有较高的参考价值，为宁泌泰胶囊“异病同治”治疗CP和BPH提供思路借鉴，并为进一步实验验证其作用机制提供理论依据。