响应曲面法优化漳州芽孢杆菌液态发酵桑叶粉营养品质的研究

姜文强，缪凌鸿,，高 亮，朱悦洁，林 艳，罗晨皓，钱琳洁，陈士友，张维娜，施大林，刘 波,，沈怀舜,，戈贤平,

（1南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081；3江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡 214063）

0 引言

桑叶是桑树的主要产物，除了具有丰富的蛋白质含量(14%～28%)和较高的氨基酸含量(34.7%)，还具有1-脱氧野尻霉素(DNJ)和黄酮、多酚、多糖等多种具有抗氧化和杀菌消炎作用的生物活性成分[1]。近年来桑叶粉作为饲料原料在水产动物上的研究逐渐增多，但桑叶粉中含有单宁、植酸等抗营养因子，并具有粗纤维含量过高的问题。微生物发酵法能够通过微生物产生的酶系将桑叶粉中的粗纤维、蛋白质等难以消化的大分子物质，分解为容易被机体吸收的小分子营养物质，增强发酵产物对自由基的清除能力以及对铁离子等诸多物质的还原能力[2]。桑叶粉中的单宁、植酸等抗营养因子在发酵过程中也会被微生物消解，从而提高发酵产物的适口性[3]，提高水产动物的摄食率及生长性能[4-5]。有报道指出，在水产饲料中添加适量的发酵桑叶粉替代鱼粉，不仅能够有效改善印度囊鳃鲶(Heteropneustes fossilis)、南亚野鲮(Labeo rohita)和巴塔野鲮(Labeo bata)的生长性能和饲料消化率，还可以促进水产动物的脂质代谢，提高抗氧化能力；但是随着发酵桑叶粉添加量的增加，饲料营养物质的表观消化率会有所下降[6-8]。因此，建立适用于桑叶粉的微生物发酵工艺是提高桑叶资源利用、开发水产新型饲料原料的重要手段之一。

微生物发酵工艺中，采用单菌株与混合菌株发酵桑叶粉均能够提高其粗蛋白含量，且不同种菌株对于桑叶粉中的营养物质和抗营养因子，提高与降解的作用各有不同[3]。例如，霉菌能够更好地提高发酵产物的粗蛋白含量，芽孢杆菌和霉菌对桑叶粉中的粗纤维具有较优的处理效果，乳酸菌和酵母菌能够更好地提高发酵桑叶粉中粗脂肪的含量[9]。此外，发酵工艺对桑叶粉品质的改变也有重要影响。针对发酵菌株建立适用的发酵工艺，可以大大提高发酵产物的品质。任元元等[3]研究发现，以枯草芽孢杆菌、米曲霉菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌等为发酵菌种，筛选、优化桑叶粉的液态发酵工艺后，发酵桑叶粉可溶性蛋白含量可以提高176.52%，氨基态氮可以提高546.34%。梁贵秋等[10]采用优化的试验条件，以冠突散囊菌E6固态发酵桑叶茶6天后发现，发酵产物中还原糖含量、氨基酸含量以及抗氧化能力均高于对照组。亦有研究表明，经过酵母菌和芽孢杆菌混合菌种[11]或者是混合霉菌[12]发酵桑叶粉后，发酵产物中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的含量均有所提高。因此，优化桑叶粉的液态发酵工艺，对促进其在水产饲料领域中的开发利用具有重要意义。

本试验旨在通过响应面方法(response surface methodology，RSM)中Box-Behnken多因子试验设计法对漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)液体发酵桑叶粉的料水比、发酵时间、发酵温度和装液量等参数进行评估，借助Design-ExpertV8.0.6综合分析确定漳州芽孢杆菌发酵桑叶粉的最佳工艺条件，并通过分析比较桑叶粉发酵前后营养物质的含量、抗氧化活性，以期为发酵桑叶粉作为水产植物性饲料原料提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 菌种JSSW-BP44，由江苏省苏微微生物研究有限公司分离保存，经鉴定分类命名为漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)，保藏编号为CCTCC No.2019989，保藏日期为2019年12月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学。试验于2018年7月—2020年9月在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心进行。

1.1.2 桑叶粉 取新鲜桑叶粉（粗蛋白含量为14.029%）于60～65℃烘干至恒重，以2200 r/min的转速粉碎桑叶4 min，经60目过筛，获得桑叶粉。

1.1.3 发酵桑叶粉 按照10%的浓度制备桑叶浆，调整其酸碱度为pH 7～8。将已装罐的桑叶培养基在121℃条件下灭菌30 min，然后冷却至室温，备用（图1）。将漳州芽孢杆菌JSSW-BP44的种子菌悬液接入装有桑叶浆的发酵罐（Biotech-5JG，保兴，中国上海）中，对照组接入等量无菌蒸馏水，再以180 r/min恒温旋转培养，得到发酵液。将发酵后的样品，在无菌条件下倒入一次性无菌平板中，于-80℃冷冻后置于冷冻干燥机中干燥（Btp-9ele0x，Sp Scientific，美国）。

图1 发酵桑叶粉制备流程

1.2 试验方法

1.2.1 液态发酵桑叶粉工艺优化单因素试验 按照1.1.3的工艺流程制备发酵桑叶粉，以粗蛋白含量为响应指标。采用单因素轮换法依次考查料水比(7.5%、10%、12.5%)、发酵时间(24、48、72 h)、发酵温度(30、35、40℃)、装液量(10%、20%、30%)对发酵桑叶粉粗蛋白含量的影响[13]。发酵初始条件为料水比10%、发酵时间48 h、发酵温度35℃、装液量20%、接菌浓度107cfu/mL。

1.2.2 液态发酵桑叶粉工艺优化响应面试验设计 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计[14]，以料水比(A)、装液量(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)4个因素为自变量进行响应面分析，优化漳州芽孢杆菌液态发酵桑叶粉的工艺，响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应曲面Box-Behnken试验因素与水平

1.3 检测指标

1.3.1 营养成分含量的测定 粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)。小肽含量的测定参考Enari等[15]的方法采用双缩脲法进行，通过式(1)进行计算。

其中，X为样品的吸光度值，Y为小肽含量。样品中肽分子量分布的测定参考武万兴等[16]的方法。样品中氨基酸的组成及含量的测定参考姜曼等[17]的方法。

1.3.2 抗氧化活性及抗营养因子含量的测定 类黄酮、总酚含量均采用北京索莱宝科技有限公司所售试剂盒（试剂盒编号BC1335、BC1345）的测定方法测定。DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力采用北京艾普希隆生物科技有限公司所售试剂盒（试剂盒编号G0128W、QZQ-2-G）的测定方法测定。总抗氧化能力(T-AOC)、抑制超氧阴离子自由基、超氧化物歧化酶(SOD)均采用南京建成生物工程研究所所售试剂盒（试剂盒编号A015-1-1、A052-1-1、A001-4-1）的测定方法测定。单宁含量采用北京索莱宝科技有限公司所售试剂盒（试剂盒编号BC1395）的测定方法测定。

1.4 统计分析

文中所有数据均以平均值±标准误表示。试验结果运用SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。在单因素试验结果的基础上，运用Design-Expert V8.0.6软件设计响应面试验和数据分析，所获得的响应面试验结果采用Origin Pro 9.0软件作图。发酵前后桑叶粉品质数据运用独立样本T检验分析进行显著性分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 料水比、装液量、发酵时间和发酵温度对发酵桑叶粉粗蛋白含量的影响

由图2A可知，料水比为10%时，发酵桑叶粉粗蛋白质含量最高(17.78%)，显著高于12.5%料水比组(P＜0.05)。装液量对发酵桑叶粉粗蛋白含量的影响不显著(P＞0.05)（图2B）。当发酵时间为48 h时，发酵桑叶粉粗蛋白含量最高；显著高于72 h发酵时间组(P＜0.05)（图2C）。发酵温度为35℃时，发酵桑叶粉粗蛋白含量最高，显著高于其余2个试验组(P＜0.05)（图2D）。根据单因素试验结果获得漳州芽孢杆菌发酵桑叶粉的最佳单因素，即料水比10%、发酵时间48 h、发酵温度35℃、装液量20%，以此作为响应面初始条件进行Box-Behnken试验设计及相关的优化试验。

图2 料水比、装液量、发酵时间和发酵温度对发酵桑叶粉粗蛋白含量的影响

2.2 Box-Behnken试验结果

2.2.1 模型的建立及显著性分析 在单因素试验结果的基础上，以漳州芽孢杆菌为发酵菌株，粗蛋白含量为响应值，将对发酵桑叶粉粗蛋白含量影响显著的4个因素料水比(A)、装液量(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)作为考察因素，试验结果与分析见表2。

表2 Box-Behnken试验结果与分析

运用Design expert V8.0.6软件对表2中得分进行拟合得回归方程，如式(2)。

对上述回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面分析试验结果方差分析

由表3可知，所建立模型的P＜0.05，显著；失拟项P＞0.05，不显著，表明模型具有较高可靠性，建模成功。经方差分析，4个因素对于发酵桑叶粉粗蛋白含量影响的主次顺序为A＞B＞D＞C，即料水比＞装液量＞发酵温度＞发酵时间。其中一次项、交互项对结果影响不显著(P＞0.05)，二次项A2、C2对结果影响显著极显著(P＜0.01)，B2对结果影响显著(P＜0.05)。

2.2.2 响应面结果 为了更系统地分析各因素对于发酵桑叶粉粗蛋白质含量的影响，使用响应面法分析各个因素间的交互作用对粗蛋白质含量的影响。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，高度越高等高线密度越大，两因素交互作用越显著，相互影响也较大。由图3可知，料水比、装液量、发酵时间、发酵温度间的交互作用均出现弧形关系，得到的响应面结果都具有一个极大值点，并且料水比、装液量、发酵时间、发酵温度间的两两相互反应等高线呈椭圆形，对粗蛋白质含量的影响较为显著。

图3 各因素交互作用对发酵桑叶粉粗蛋白含量影响的响应面及等高线

利用Design-Expert软件对所得的回归方程进行最优条件分析，得出漳州芽孢杆菌液态发酵桑叶粉的最优条件为料水比5.82%、装液量11.69%、发酵时间60.89 h、发酵温度33.73℃，在此条件下发酵液粗蛋白含量为17.814%。为便于实际操作，调整条件为料水比5.8%、装液量11.7%、发酵时间61 h、发酵温度34℃。在此条件下做3组平行试验进行验证，所得产物粗蛋白含量的平均值为17.456%，相对偏差为0.022%，产物的粗蛋白含量与模型预测值相对误差为2.01%，预测精准度较高，说明此模型可靠。

2.3 桑叶粉及发酵桑叶粉肽分子量的分布比较

由图4可知，桑叶粉中桑叶蛋白主要由蛋白分子量＜1000 Da的小分子蛋白质构成，含量达97.62%。经过漳州芽孢杆菌发酵后，发酵桑叶粉蛋白分子量＜1000 Da的蛋白质含量为97.4%。发酵后产物中180～3000 Da的蛋白质含量极显著高于发酵前(P＜0.01)，而＜180 Da的蛋白质含量极显著低于发酵前(P＜0.01)。

图4 桑叶粉及发酵桑叶粉肽分子量的分布比较

2.4 发酵前后桑叶粉营养成分和氨基酸组成的比较

由表4可知，桑叶粉在料水比为5.8%、装液量为11.7%、发酵时间为61 h、发酵温度为34℃的优化试验条件下，经由漳州芽孢杆菌进行液态发酵后，发酵桑叶粉的粗蛋白含量由14.029%显著提高到17.456%(P＜0.05)，粗脂肪含量较未发酵之前显著提高147.3%(P＜0.01)；发酵产物中灰分和总能的含量较桑叶粉无显著提高。桑叶粉和发酵桑叶粉共检测到17种水解氨基酸，发酵桑叶粉氨基酸总量和必需氨基酸含量分别为11.26%和5.24%，均显著高于桑叶原粉(P＜0.05)，其中必需氨基酸苏氨酸(P＜0.05)、苯丙氨酸(P＜0.01)和非必需氨基酸丝氨酸(P＜0.05)、甘氨酸(P＜0.05)、丙氨酸(P＜0.01)的含量经过发酵之后显著提高。

表4 桑叶粉及发酵桑叶粉营养成分和氨基酸组成

2.5 发酵前后桑叶粉品质的比较

由表5可知，优化条件下液态发酵所得桑叶粉的小肽含量为235.46 mg/g，较发酵前显著提高21.63%(P＜0.01)。发酵桑叶粉中单宁、类黄酮和总酚含量分别显著降低34.70%(P＜0.01)、13.87%(P＜0.05)和8.99%(P＜0.01)，且总抗氧化能力(P＜0.01)、抗超氧阴离子活力(P＜0.01)、超氧化物歧化酶活力(P＜0.01)和DPPH自由基清除率(P＜0.05)均显著提高。发酵桑叶粉对羟自由基的清除率较发酵之前提高14.49%(P＞0.05)。

表5 桑叶粉及发酵桑叶粉品质的比较

3 讨论

3.1 液态发酵对桑叶粉营养成分的影响

提高植物蛋白源粗蛋白含量的方法通常有超声波提取法、浸提法、酶解法和微生物发酵法等。微生物发酵植叶产物的粗蛋白、粗脂肪含量均能够得到不同幅度的提高，这与发酵菌种、培养基组成以及发酵条件有关。例如，采用不同复合菌株发酵花生茎叶，其发酵产物粗蛋白含量可提高25.28%或50.22%[18-19]，用酿酒酵母菌或植物乳杆菌分别发酵青蒿叶和青蒿叶渣，其发酵产物粗蛋白含量可分别提高43.05%和85.30%，粗脂肪含量分别提高106%和87.73%[20]。汤小朋等[21]在用黑曲霉菌固态发酵木薯渣后发现，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%。本试验中，由漳州芽孢杆菌在优化的发酵条件下所制得的发酵桑叶粉粗蛋白和粗脂肪含量均得到显著提高，说明由响应面模型评估所获得漳州芽孢杆菌的发酵条件适宜桑叶粉的液态发酵。在发酵过程中菌体蛋白的大量分泌，使得发酵产物粗蛋白和粗脂肪的含量得到提高[20]。并且相较于其他方法，微生物发酵法能够分解原料中的大分子物质，产生更多易于消化吸收的小分子物质，诸如多肽、游离氨基酸等[22]。微生物发酵过程中还可以产生有机酸、益生元和芳香味物质，降低抗营养因子，增强抗氧化能力，提高原料适口性，促进动物的生长[23]。微生物发酵法在银杏叶、辣木叶以及香蕉茎叶等饲料原料中的应用多有报道，且大多为多菌种的混合发酵[24-26]。本试验以漳州芽孢杆菌作为单一发酵微生物，利用其分泌的脂酶、蛋白酶、纤维素酶等将桑叶粉中难以消化的大分子蛋白分解为小肽（低聚肽，分子量180～1000 Da）和游离氨基酸（分子量＜180 Da），从而提高动物对发酵桑叶粉的消化利用[27-29]。相较于游离氨基酸，小肽能够直接被肠道消化，不增加肠道负担，不消耗机体的能量；并且能够作为载体将营养物质和微量元素输送到机体的各个部位；且在抗氧化、降糖降脂等方面的生物活性高于大分子蛋白质和游离氨基酸[30-32]。本试验获得的发酵桑叶粉中小肽含量显著增加，说明桑叶原粉中的大分子蛋白在漳州芽孢杆菌的作用下可有效分解为小肽，进而被分解为游离氨基酸[33-35]。而到了发酵中后期，培养基中的漳州芽孢杆菌大量繁殖，游离氨基酸居于培养基中可利用氮源的首位[17]，可能导致发酵桑叶粉中游离氨基酸（肽分子量＜180 Da）所占比例低于桑叶粉。

原料氨基酸的配比和含量的高低是评价其蛋白质品质优劣的重要指标。棉粕经复合芽孢杆菌固态发酵6天后，其产物中总游离氨基酸含量可提高9.98%[36]。米曲霉菌固态发酵大麦、少孢根霉菌固态发酵玉米和高粱所得的3种发酵产物的总氨基酸含量可分别增加1.71%、5.11%、2.44%[37]。豆粕经枯草芽孢杆菌发酵72 h后，总氨基酸含量可提高8.35%[38]。在氨基酸组成方面，发酵桑叶粉所测得17种氨基酸含量均高于桑叶粉，且总氨基酸和必需氨基酸含量较桑叶粉显著提高6.71%和6.72%，说明漳州芽孢杆菌在桑叶粉发酵过程中所产生的蛋白酶可将桑叶粉中的大分子蛋白降解为氨基酸，从而提高发酵桑叶粉中总氨基酸和必需氨基酸的含量[39]；另一方面也证明本试验建立的发酵条件适用于液态发酵桑叶粉[40]。由于微生物参与了液态发酵过程，发酵桑叶粉中苏氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸组成的变化可能归因于原料发酵过程中的微生物代谢[5]。

3.2 液态发酵对桑叶粉品质的影响

微生物发酵除可能影响发酵底物的营养和氨基酸组成外，对抗营养因子和抗氧化还原物质的含量也有一定影响。单宁是存在于植物中的一种次生代谢产物，是植物性蛋白源中主要的抗营养因子，其可与生物体内的蛋白质及消化酶等结合，降低生物对植物蛋白的利用率[41]。研究发现，朱缨花粉在经过罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌和枯草芽孢杆菌复合发酵后，其单宁含量显著降低30.20%～48.32%[42]。菜籽饼粕经枯草芽孢杆菌等6种菌株复合发酵5天之后，其单宁降解率最高达到36.59%[43]。本试验也获得相似的结果，经漳州芽孢杆菌发酵后的产物中单宁含量显著降低34.71%，说明漳州芽孢杆菌在优化的发酵条件下能够通过酶促或非酶促等多种途径来降解植物性原料中的抗营养因子[4-5]。总酚和类黄酮均是桑叶酚类物质中的一种，具有很好的抑菌消炎、抗氧化活性和较强的自由基清除率[44-45]。桑叶粉在发酵过程中酚类物质的减少可能是发酵过程中会产生降解酚类物质中不稳定酚羟基的酶类；也有可能是发酵过程中培养基还原糖的含量和pH的变化等诸多因素会对其酚类物质的含量产生影响[46]。虽然具有抗氧化活性的总酚和类黄酮含量降低，但是在本试验中发酵桑叶粉的DPPH清除率、总抗氧化能力、抗超氧阴离子活力、超氧化物歧化酶活力均显著提高。微生物在发酵过程中所产生的酶类不仅会作用于酚类物质，也会对发酵产物中的多糖类化合物产生影响，可能使大分子葡萄糖苷类化合物转化为小分子苷元，使得发酵桑叶粉的抗氧化能力得到提高[47]。另外，发酵产物中具有抗氧化活性的物质除了酚类物质与多糖类化合物外，发酵底物中所含的多肽类化合物经酶水解之后肽键断裂，部分具有抗氧化效用的氨基酸残基暴露也会对发酵产物抗氧化能力的提高起到一定的作用[27,40]。

4 结论

本试验以桑叶粉为原料，选用漳州芽孢杆菌JSSW-BP44为发酵菌种，以发酵桑叶粉的粗蛋白含量为响应值，通过单因素和响应面试验确定漳州芽孢杆菌发酵桑叶粉的最优条件，分别为料水比5.8%、装液量11.7%、发酵时间61 h、发酵温度34℃。在优化条件下发酵所得的产物粗蛋白、粗脂肪和小肽含量分别提高24.4%、147.3%和21.61%，抗营养因子单宁含量降低34.71%。其必需氨基酸及总氨基酸含量显著上升。此外，发酵桑叶粉DPPH自由基、羟自由基的清除率分别达到93.26%和81.84%，较发酵之前提高10.83%和14.49%，具有更强的抗氧化活性。总体而言，本研究获得的漳州芽孢杆菌发酵条件适用于桑叶粉的液态发酵，通过该条件液态发酵所得的发酵桑叶粉具有更佳的营养价值、抗氧化活性以及适口性，为水产饲料植物型原料的开发提供了新的思路和理论依据。