广西多穗石柯根皮苷的提取及纯化工艺研究

秦荣秀，杨 漓，李桂珍，谷 瑶

（广西壮族自治区林业科学研究院，南宁 530002）

0 引言

多穗石柯(Lithocarpus polystachyus)又名甜茶，广泛分布于广西壮族自治区平果、隆林、马山、巴马和龙州等地区[1-2]，其嫩叶可作为茶叶饮用，具有解暑、治疗肺热和咳嗽等作用[3]。多穗石柯是一种药食同源性植物，其主要化学成分是黄酮类和三萜类。黄酮类中的根皮苷、三叶苷和3-羟基根皮苷是多穗石柯主要的甜味物质，主要分布于多穗石柯叶片中[4-5]。根皮苷作为中国民间中药的主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用[6]，已被证实可以作为SGLT2抑制剂，促进葡萄糖从尿中排出[7-8]，其开发价值和临床应用前景广阔。

目前，根皮苷的提取方法主要有醇提法[9]、碱性水提取法[10]、超声辅助提取法[11]和微波辅助提取法[9]等。根皮苷的分离纯化方法有萃取法[12]、大孔树脂吸附法[13]、壳聚糖絮凝法[9]、聚酰胺层析柱分离法[12]和高效离心分配色谱法[14]等。朱珊等[15]利用水提苹果枝，树脂柱粗分离，中低压柱色谱细分的方法制备出的根皮苷标准品纯度达到98%以上。袁健童等[16]采用70%的乙醇浸提，硅胶柱色谱梯度洗脱，制备色谱分离纯化，获得根皮苷纯度98%以上的对照品。王慧莹[9]采用微波辅助水提取法提取多穗柯根皮苷，并选择ADS-7型大孔树脂对根皮苷进行进一步纯化，根皮苷得率的平均值为3.09%，纯化后纯度从21.93%增加到58.6%。赵斐文[17]以苹果树枝、叶为原料，70%甲醇为提取剂，得到根皮苷纯度68%。陈阳[14]采用超声辅助提取法从多穗柯叶中提取根皮苷，并用D-101型大孔树脂分离纯化，获得根皮苷得率为3.83%，根皮苷纯度由27.62%增加到72.37%。王代波等[18]采用微波辅助提取多穗柯根皮苷，根皮苷得率为1.392%。黄帅等[19]以60%乙醇为提取溶剂，采用回热提取法和超声波萃取法对木姜叶柯老叶中的根皮苷进行提取，得率分别为9.53%和8.72%。徐凯、丰金玉等[20-28]在根皮苷的提取和纯化方面进行了大量的研究，也取得了可喜的进展，但采用萃取法分离得到的根皮苷得率和纯度不高。笔者采用萃取法对多穗石柯根皮苷的提取和纯化工艺进行研究，并优化工艺条件，以期获得得率较高且根皮苷纯度达到90%以上的工艺条件，为根皮苷的进一步深入研究和工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多穗石柯叶（叶龄超过6个月）采自广西林科院老虎岭种植基地；根皮苷（纯度大于98%）标准品购自中国食品药品检定研究院；液相用的甲醇和乙腈为色谱纯；提取用的无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇等为分析纯。

中草药粉碎机，天津泰斯特FY130；超声波清洗器，昆山禾创KH-1000KDB；低温高速离心机，德国SIGMA3-30K；旋转蒸发仪，上海亚荣生化RE-52AA；鼓风干燥箱，苏州德瑞普DRP-8803；高效液相色谱仪，Waters e2695；电子分析天平，瑞士普利赛斯，BJ210C；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 多穗石柯叶经干燥、粉碎、研磨、过筛，密封保存备用。称取一定量的样品，置于500 mL锥形瓶中，加入乙醇溶液浸泡、超声、离心，收集上层液，加入乙酸乙酯分3次进行萃取，收集萃取液进行浓缩，浓缩液加入甲醇分3次纯化萃取，萃取液浓缩，浓缩得粘稠状物质加水溶解，然后加入活性炭吸附、过滤，滤液结晶后再重结晶即得根皮苷产品。具体工艺流程见图1。

图1 根皮苷提取纯化工艺流程

1.2.2 试验设计 以多穗石柯叶为试验材料，根皮苷的得率和纯度为考察指标，分别考察不同粉碎程度、乙醇浓度、料液比、浸泡时间、超声时间、离心时间和甲醇浓度7个因素对根皮苷得率和纯度的影响。固定乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡24 h，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度为50%，粉碎程度为10、20、30、40、50目；固定粉碎程度为30目，料液比1:15，浸泡24 h，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度为50%，乙醇浓度45%、55%、65%、75%、85%；固定粉碎程度为30目，乙醇浓度为75%，浸泡24 h，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度为50%，料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25；固定粉碎程度为30目，乙醇浓度为75%，料液比1:15，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度为50%，浸泡时间8、16、24、32、40 h；固定粉碎程度为30目，乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡24 h，离心15 min，甲醇浓度为50%，超声时间10、15、20、25、30 min；固定粉碎程度为30目，乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡24 h，超声20 min，甲醇浓度为50%，离心时间5、10、15、20、25 min；固定粉碎程度为30目，乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡24 h，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度30%、40%、50%、60%、70%。

1.2.3 样品制备 称取1 g根皮苷产品，用少量甲醇溶解，定容到10 mL，涡旋混匀30 s，供液相色谱检测。如果样品浓度超过标准工作曲线范围，则将样液用甲醇稀释一定的倍数，使其浓度在线性范围之内。

1.2.4 样品检测 用高效液相色谱测定并制作标准曲线，色谱条件为Symmetry ShieldTM RP18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相为0.02%甲醇/水和乙腈；流速1.0 mL/min；柱温40℃；检测波长284 nm。进样量20 μL，流动相梯度洗脱，具体数据见表1。

表1 流动相梯度洗脱数据

1.2.5 标准曲线的绘制 用分析天平准确称取根皮苷标准样品0.05 g，用甲醇完全溶解后，定容到50 mL容量瓶中，得到浓度为1 mg/mL的标准溶液。分别取0.5、2、4、6、8 mL的1 mg/mL的标准溶液溶于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容到刻度摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液供测试，测得根皮苷的标准曲线如图2所示。

图2 根皮苷的标准曲线

以根皮苷标准液的浓度ρ为横坐标，HPLC峰面积A为纵坐标进行回归，如式(1)。

1.2.6 计算方法 根皮苷得率(W)的计算如式(2)～(3)。根皮苷纯度(P)的计算如式(4)。

式中，M0为提取前干叶子的质量，g；L为标准液体积，mL；M1为根皮苷的质量，g；m为纯化后根皮苷的质量，g。

1.3 数据处理

所有指标均重复测量3次，检测结果以平均值表示。数据处理均采用Microsoft Office Excel 2007软件完成。

2 结果与分析

2.1 原料粉碎程度对根皮苷的得率和纯度的影响

由图3可见，根皮苷原料的不同粉碎程度对得率和纯度存在一定的影响。根皮苷的纯度随着目数的增大而增大，超过30目后纯度变化不大；得率随着目数的增大而增大，但超过30目后增大减缓。出现这种情况可能是根据菲克定律，植物原料越细，扩散速度越快，但粉碎过细，植物细胞被破坏，可溶性高分子化合物即杂质进入溶媒中增加了提取液黏度，妨碍了溶媒进入细胞继续进行提取。因此，在开展实验的时候选择粉碎程度为30目。

图3 原料粉碎程度对根皮苷得率和纯度的影响

2.2 不同乙醇浓度浸提液对根皮苷纯度和得率的影响

由图4可以看出，不同乙醇浸提液浓度对根皮苷得率和纯度有一定的影响，但对纯度的影响不大。随着乙醇浸提液浓度的升高，根皮苷的得率增加，乙醇浓度增加到75%时，根皮苷的得率为7.63%；当浓度提高到85%的时候，根皮苷的得率仅提高到7.79%，增幅不大。说明乙醇浓度只有在一定范围内的增加才能增大根皮苷的溶出，并不是浓度越高越好。因此，选择75%的乙醇浓度作为浸提浓度。

图4 乙醇浓度对根皮苷得率和纯度的影响

2.3 不同料液比对根皮苷纯度和得率的影响

由图5可以看出，不同料液比对根皮苷的得率和纯度都有影响。随着料液比的增大，根皮苷的纯度先增大后降低，峰值出现在1:15附近。根皮苷的得率随着料液比的增大而增大，在料液比超过1:15之后增加比较缓慢。说明在一定范围内增加溶剂量可以提高醇溶性根皮苷的溶出量，但继续增加溶剂根皮苷的溶出率达到饱和或影响超声波对样品的作用，导致根皮苷的得率和纯度增加缓慢或稍有降低。因此，在浸提过程中选择料液比为1:15。

图5 料液比对根皮苷得率和纯度的影响

2.4 不同浸泡时间对根皮苷纯度和得率的影响

从图6可以看出，不同浸泡时间对根皮苷得率和纯度都有较大的影响。随着浸泡时间的延长，根皮苷的纯度先升高后降低，在浸泡时间为24 h左右达到最高值；根皮苷的得率随着浸泡时间的延长而增大，但超过24 h后增大放缓，根皮苷的溶出逐渐达到饱和。因此，选择24 h为根皮苷提取的浸泡时间。

图6 浸泡时间对根皮苷得率和纯度的影响

2.5 不同超声时间对根皮苷纯度和得率的影响

从图7可以看出，超声时间对根皮苷的得率和纯度都有一定的影响，随着超声时间的延长，根皮苷的得率和纯度都是先增大，后期基本不变，得率和纯度均在20 min左右达到最高值。出现这种情况的原因可能是随着超声时间的延长，多穗石柯老叶中的根皮苷和其他醇溶性物质被逐渐溶出，达到20 min时基本全部溶出。因此，在实验过程中选择20 min为根皮苷的超声时间。

图7 超声时间对根皮苷得率和纯度的影响

2.6 不同离心时间对根皮苷纯度和得率的影响

从图8可以看出，不同的离心时间对根皮苷得率和纯度的影响不大，得率和纯度的最大值出现在15 min左右。因此，选择15 min为根皮苷提取的离心时间。

图8 离心时间对根皮苷得率和纯度的影响

2.7 不同甲醇浓度对根皮苷纯度和得率的影响

从图9可以看出，随着甲醇浓度的升高，根皮苷的得率和纯度先升高后降低，但降低的幅度不大，得率和纯度的最大值出现在甲醇浓度50%左右。因此，选择甲醇浓度50%为根皮苷的纯化浓度。

图9 甲醇浓度对根皮苷得率和纯度的影响

2.8 方法的稳定性考察

在多穗石柯干叶粉过30目筛，乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡24 h，超声20 min，离心15 min，甲醇浓度50%等条件下，重复3次实验，所得的根皮苷的得率和纯度见表2，同时对根皮苷产品开展了加样回收率实验，结果见表3。

由表2和表3可以看出，根皮苷的得率和纯度的相对标准偏差分别为1.36%和0.28%；加样平均回收率为99.36%，相对标准偏差为0.81%，相对标准偏差数值不大，说明采用该方法进行根皮苷的提取和纯化可行，所得结果相对比较稳定。

表2 根皮苷的纯度和得率%

表3 加样回收率实验结果(n=6)

3 结论

通过对多穗石柯老叶进行干燥、粉碎、过筛、浸泡、超声、离心、萃取、浓缩、纯化等工序提取根皮苷产品，获得根皮苷提取纯化的最佳工艺条件为：多穗石柯干叶粉碎过30目筛，乙醇浓度为75%，料液比1:15，浸泡时间为24 h，超声时间为20 min，离心时间为15 min，甲醇浓度为50%。在此工艺条件下开展稳定性实验，根皮苷的平均得率为7.63%，平均纯度为91.10%，相对标准偏差分别为1.36%和0.28%，表明方法的稳定性较好。

4 讨论

笔者开展了根皮苷的提取和纯化工艺的改进研究，从多穗石柯叶中提取的根皮苷得率为7.63%，平均纯度为91.10%，均高于文献报道的数据。王慧莹[9]提取的多穗柯根皮苷得率的平均值为3.09%，纯度为58.6%。陈阳[14]提取多穗柯叶中根皮苷得率为3.83%，纯度达到72.37%。获得根皮苷纯度比较高的有朱珊等[15]利用水提苹果枝制备出的根皮苷标准品，纯度达到98%以上，但未见有得率数据。获得根皮苷得率比较高的有黄帅等[19]对木姜叶柯老叶中的根皮苷的提取，得率最高达9.53%，但未提及根皮苷的纯度。

通过改进工艺，根皮苷的得率和纯度得到一定的提高，但改进后的工艺流程长、步骤较多、耗时较长，在一定程度上增加了生产成本，故要想获得根皮苷纯度和得率高且工艺简单的生产工艺还有待进一步研究。