益生菌固态发酵红薯渣条件的研究

王 微， 梅世慧， 陈江凤， 陈 超， 周碧君，2，3， 文 明，2，3

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点试验室；贵州贵阳 550025；3.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州贵阳 550025）

1 材料与方法

1.1 主要材料 产朊假丝酵母（Candida utilis，C.u）与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，L.p），购自上海保藏生物科技有限公司； 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.c）、 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，B.l）、 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis，B.s）、短 小 芽 孢 杆 菌（Bacillus pumilus，B.p）与粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E.f），由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供。 红薯，购自贵州惠民生鲜超市。 YPD 培养基，购自北京百奥莱博科技有限公司；普通营养培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；MRS 培养基， 购自索莱宝生物科技有限公司。

1.2 主要仪器 BD53 恒温培养箱 （德国宾得公司），QYC-2102C 恒温摇床（上海新苗医疗器械制造公司），K9860 全自动凯氏定氮仪 （海能未来技术集团股份有限公司），WA-003 破壁榨汁机 （颍上力程仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵底物制备 红薯洗净切块， 放入榨汁机打碎，三层纱布过滤，放入白瓷盘，置于60 ℃烘箱，20 min 搅拌一次，2 h 取出， 置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 益生菌复苏及种子液制备 无菌环挑取菌种接种相应培养基（酵母菌接种YPD 培养基、乳酸菌接种MRS 培养基、 芽孢杆菌接种普通营养培养基），酵母菌30 ℃、乳酸菌和芽孢杆菌37℃恒温培养24 h；挑取单个菌落接种相应液体培养基，恒温摇床（180 r/min）培养12 h，取3 mL菌液接种相应100 mL 液体培养基中， 恒温摇床（180 r/min）培养24 h 取出种子液；采用平板稀释涂布法测定种子液菌液浓度，用灭菌水稀释至1×109cfu/mL，放入4 ℃冰箱备用。

1.3.3 益生菌拮抗试验 取益生菌种子液， 分别划线于YPD 培养基、MRS 培养基与普通营养培养基，37 ℃恒温培养24 h，观察生长情况，筛选均适宜7 株益生菌生长的培养基； 再取7 种益生菌划线，观察拮抗性。

1.3.4 基于粗蛋白质产物菌株筛选 参考欧荣娣等（2015）方法，按3%（V/m）接种量，将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌与粪肠球菌菌液接种于100 g 红薯渣中，30 ℃恒温发酵3 d 取出，60 ℃烘干恒重，通过国标GB/T 6432-2018 测定粗蛋白质含量，以粗蛋白质含量为指标进行益生菌菌株筛选。

1.3.5 复合益生菌固态发酵条件优化

第五孔窑洞开间3.28m，进深7m，室内空间狭长，此处是装载粮食的空间，南侧设窗但不设门，进入此处只能通过第四孔窑洞，这样既保证了室内的通风采光，使粮食的存放时间更长，也保证了粮食的存放安全，避免了外来人直接进入粮食装载区。

1.3.5.1 单因素试验 以粗蛋白质含量高的4 种益生菌以1：1：1：1 混合， 于0%、1%、3%、5%、7%和9%（V/m）接种量接种100 g 红薯渣，30 ℃恒温发酵3 d 取出，测定粗蛋白质含量，筛选出最佳菌液接种量。 以最佳接种量接种8 袋红薯渣，30 ℃恒温发酵，于0、1、2、3、4、5、6 d 和7 d 取出，测定粗蛋白质含量。

1.3.5.2 正交试验 采用L9（34）正交试验设计，以粗蛋白质含量为指标，根据单因素试验结果以最佳接种量和最佳发酵时间前后两个值， 与发酵温度（28、30、32 ℃）进行正交试验。

1.3.6 红薯渣最佳发酵条件验证 根据上述筛选得到的最佳条件（益生菌菌种、接菌量、发酵时间和发酵温度）进行发酵，以粗蛋白质含量为指标验证。

1.4 数据统计与分析 上述试验均设三个重复，检测结果数据用SPSS 软件进行分析， 以 “平均值±标准差” 表示， 其中P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 益生菌拮抗试验结果 酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌在YPD 培养基生长：7 种益生菌拮抗试验结果如图1， 其中产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌拮抗， 植物乳杆菌与短小芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌拮抗， 粪肠球菌与短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌拮抗。

图1 益生菌拮抗性试验结果

2.2 基于粗蛋白质含量菌种筛选结果 7 种益生菌发酵红薯渣中粗蛋白质含量变化结果见表1；由高至低顺序分别为： 产朊假丝酵母＞地衣芽孢杆菌＞植物乳杆菌＞酿酒酵母＞粪肠球菌＞枯草芽孢杆菌＞短小芽孢杆菌， 较未发酵红薯渣显著提高29.92% 、25.76% 、15.51% 、14.40% 、11.63% 、5.54%、1.11%（P＜0.05）。 根据拮抗试验植物乳杆菌与地衣芽孢杆菌拮抗，因此添加产朊假丝酵母、酿酒酵母、植物乳杆菌和粪肠球菌（1：1：1：1）复合发酵。

表1 7 种益生菌发酵红薯渣中粗蛋白质含量%

2.3 复合益生菌固态发酵条件优化

2.3.1 单因素试验 添加产朊假丝酵母、 酿酒酵母、植物乳杆菌和粪肠球菌（1：1：1：1）混合菌液，于不同接种量发酵， 红薯渣中粗蛋白质含量变化结果见图2； 粗蛋白质含量随菌液接种量的增加先升高后下降。 以最佳接种量5%进行不同时间发酵，结果见图3；粗蛋白质含量随时间延长先上升后下降，最佳发酵时间为4 d。

图2 不同接种量粗蛋白质含量

图3 不同发酵时间粗蛋白质含量

2.3.2 正交试验结果分析 以粗蛋白质含量为指标， 根据单因素试验结果最佳接种量和最佳发酵时间前后两个值 （3、4、5 d） 和 （3%、5%、7%），与发酵温度（28、30、32 ℃）进行正交试验，因素水平组合见表2。正交试验结果见表3，3 个因素主次顺序为C＞B＞A；最佳发酵条件为A1B3C3， 即发酵时间3 d， 菌液接种量7%， 温度32℃。 正交试验方差分析结果见表4，表明A、B、C 3 个因素对提高发酵红薯渣中粗蛋白质影响差异均不显著。

表2 红薯渣发酵条件优化正交试验因素与水平

表3 红薯渣固态发酵工艺条件L9（34）正交试验结果与分析

2.4 红薯渣最优发酵条件验证 于最佳发酵条件添加产朊假丝酵母+酿酒酵母+植物乳杆菌+粪肠球菌（1：1：1：1）混合菌液，接种量7%、32 ℃发酵3 d，测定粗蛋白质含量进行验证，结果见图4；较未发酵红薯渣中粗蛋白质显著提高39.27%（P＜0.05），与正交试验No.2 条件发酵红薯渣中粗蛋白质含量（4.47±0.056）（P＞0.05）差异不显著，表明红薯渣最优发酵条件可行。

图4 最优发酵条件粗蛋白质含量变化

3 讨论

红薯渣由于水分过多难以保存与利用， 烘干成本高且破坏红薯渣中酚类化合物与胡萝卜素等成分。 Shen 等（2018）研究发现，利用益生菌发酵红薯渣可延长保存时间、改善风味、保留胡萝卜素以及酚类物质。Shivashankara 等（2004）研究表明，益生菌发酵红薯渣能够有效提高抗氧化酚、 脂肪酸和植物固醇含量， 其中抗氧化酚可抑制癌细胞增殖。益生菌生长繁殖过程中会产生有机酸，包括乳酸、乙酸和丁酸等，可降低肠道pH，抑制病原菌生长（袁明贵，2021；Mu，2020；翟羽佳，2018）。 综上所述益生菌发酵红薯渣可产生营养物质、 抗氧化物质、益生物质并延长保存时间，因此研究发酵红薯渣作为动物饲料具有重要意义（Klempová，2020；王明瑞，2020；Shi，2017）。

本研究以粗蛋白质为指标， 添加筛选得到的4 种益生菌复合发酵， 于不同接种量和不同发酵时间进行单因素试验。不同接种量发酵，红薯渣中粗蛋白质含量先上升后下降； 由于添加菌液量过大，使微生物生长速率加快，营养消耗释放能量，发酵温度提高，导致酵母菌失活；与宋平等（2018）和陈洪伟等（2011）研究发酵糟渣中，接种量增大粗蛋白质含量先上升后下降结果相一致。 不同时间发酵，红薯渣中粗蛋白质含量先升高后下降；因为益生菌生长繁殖分迟缓期、对数期、稳定期与衰亡期，进入衰亡期发酵能力逐渐降低，所以导致粗蛋白质含量下降；与苏玲（2021）研究油茶籽湿渣发酵随发酵时间延长粗蛋白质含量先上升后下降结果一致。

不同发酵条件可直接影响红薯渣中粗蛋白质含量，本研究通过正交试验对3 种发酵条件（菌液接种量、发酵时间和发酵温度）进行优化。 添加2种酵母菌（产朊假丝酵母和酿酒酵母）与2 种细菌（植物乳杆菌和粪肠球菌）复合发酵，酵母菌与细菌适宜生长温度不同， 两种益生菌生长温度相差7 ℃， 筛选适宜复合菌种生长繁殖温度至关重要（陈明，2021；林森，2008）；通过正交试验确定最佳发酵温度为32 ℃，可使产朊假丝酵母、酿酒酵母、植物乳杆菌和粪肠球菌4 种益生菌生长繁殖达到最适温度。 发酵时间会直接影响红薯渣中粗蛋白质含量， 发酵时间过短红薯渣中成分未完全利用，发酵时间过长生产成本高；本研究最佳发酵时间为3 d， 该发酵时间能高效利用红薯渣中残留的营养成分，与陈炳钿等（2020）研究最优发酵工艺中最佳发酵时间3 d 相一致。 相较单因素试验最优发酵条件5%接种量于30 ℃发酵4 d， 正交试验中最佳条件7%接种量32 ℃恒温发酵3 d，增加2%接种量提高2 ℃发酵温度可缩短1 d 发酵时间，可有效降低工业生产成本。

欧荣娣等（2015）研究的红薯渣固态发酵条件优化，将红薯渣高压灭菌后发酵，灭菌红薯渣发酵费时费力；本研究采用未高压的红薯渣发酵，不仅降低工作量，还防止高压使红薯渣蛋白产生变性，更符合生产实际。 综上所述添加益生菌发酵红薯渣可有效提高红薯渣中粗蛋白质含量， 为发酵红薯渣工艺奠定理论基础。

4 结论

本研究筛选出产朊假丝酵母、酿酒酵母、植物乳杆菌和粪肠球菌4 种益生菌，以1：1：1：1 复合发酵，确定最佳发酵条件为菌液接种量7%（V/m）、温度32 ℃和时间3 d，表明益生菌发酵红薯渣可提高粗蛋白质含量。