饲源等多因素下牛奶中芽孢杆菌危害及热处理效果分析

郭利亚 ， 赵广英， 张养东， 张 伟， 白跃宇， 张晓建

（1.河南科技学院，河南新乡 453003；2.河南花花牛乳业集团，河南郑州 450064；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

芽孢杆菌是一类在一定条件下能形成芽孢的细菌。芽孢不是细菌的繁殖体，是产芽孢菌的内生孢子，多呈圆形或椭圆形，含水量低，其也是产芽孢菌的休眠体，具有一定抗逆性，包括抗酸碱、抗辐射、抗压力等（何国庆等，2019）。 芽孢杆菌来源多、分布广，奶牛养殖、牛奶储运及加工等过程，都可引起芽孢杆菌污染牛奶，而饲草料、饲用饮水、饲养管理等是主要的污染风险因素。 热处理是牛奶杀菌的常用方式之一， 是乳品生产中有效保证奶产品安全和延长保质期而广泛采用的一种加工工艺。热处理主要目的和基本目标，是杀死奶中的病原微生物、 大多数腐败菌和灭活奶中内源性酶或微生物分泌酶等， 确保奶产品品质和食用安全（张养东等，2020）。

牛奶的热处理工艺体系中， 巴氏杀菌和超高温灭菌，是最常见的两类热处理方法。不同热处理工艺的选择取决于生乳质量、 产品质保和质量状态等要求。通常经过高温灭菌后，奶中的大部分细菌几乎都可被杀死，使产品达到商业无菌。但李笑坤和殷文政（2014）研究认为，如果奶中有芽孢杆菌以芽孢的形式存在， 芽孢耐受高温灭菌而存活的几率增大， 存活的芽孢数量超过商业无菌的限值，奶产品在环境条件适合时，萌发重新变为细菌繁殖体的可能性增强，进而大量生长繁殖，使奶产品产生酸味和腐败味， 导致奶产品质量安全风险增加。这不仅影响口感和营养摄入，对人体健康也会造成潜在威胁。

1 奶中芽孢杆菌存在特点和危害

1.1 生乳中的芽孢杆菌 生乳产自于奶畜养殖场（区、户）或各类牧场，饲草料、饲用饮水、饲养管理等饲源因素， 是生乳中细菌等微生物一个主要的污染风险来源。 在细菌分类中，芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、脱硫胎状菌属和芽孢八叠球菌属为主要的五种产芽孢菌类微生物，其中，前三种较为常见。 在生牛乳中，芽孢杆菌属检出率较高，其可分解奶中的营养物质，是污染可能性较大的一类产芽孢菌， 也是奶产品生产中重点监测的一个质量安全指标（任俊琦等，2009）。

生乳中的芽孢杆菌，是形成孢子的主要细菌，常分离到的几种芽孢杆菌有地衣芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等，其中蜡状芽孢杆菌最为多见（张养东等，2020；何国庆等，2019）。有研究发现，生牛乳中常温芽孢数小于100 cfu/mL，最高可达1000 cfu/mL，耐高温芽孢较少，在20 cfu/mL 以下。 在受污染生乳耐热芽孢菌中，枯草芽孢杆菌检出率最高，占比30%，蜡样芽孢杆菌占19%，短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、 栗褐芽孢杆菌分别占11%、8%、8%和3%（龟井俊郎，1996）。 枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌比蜡状芽孢杆菌耐热程度大， 牛奶热处理加工工艺不易完全杀灭， 是引起杀菌或灭菌后奶产品腐败变质一个重要因素。

1.2 乳制品中的芽孢杆菌 生乳中微生物是影响乳制品货架期的一个主要原因，特别是乳品热处理杀菌不彻底而存留的芽孢杆菌，在一定条件下其可分解巴氏杀菌奶、 发酵乳等奶产品中的蛋白质、脂肪等物质，造成营养成分损失，导致奶产品产气和涨袋（张养东等，2020）。同时，使奶产品的滋气味发生变化， 主要是乳蛋白质分解后产生腐败气味，脂肪分解产生酸败味等。 存留在牛奶中的芽孢杆菌，还可利用乳糖产酸，造成甜炼乳等奶产品黏稠度提高，影响产品正常质地和状态。在灭菌乳制品中，检出残留的蜡样芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等情况较多。 在乳品生产中，杀菌过程不能完全被杀灭的芽孢杆菌， 贮存过程中条件适宜情况下易激活、繁殖、生长，从而导致奶产品变质等质量问题。

芽孢杆菌中产毒素菌株的蜡样芽孢杆菌具有致病性。 蜡样芽孢杆菌，是一种无荚膜、能运动、兼性好氧革兰氏阳性杆菌。 蜡样芽孢杆菌可产肠毒素，其肠毒素具致吐、致腹泻危害，误食蜡样芽孢杆菌污染的食物，一般短时间内会出现呕吐、腹泻等胃肠道消化系统不适等症状（何国庆等，2019；刘绍军，2006）。 Finlay 等（2000）发现，蜡样芽孢杆菌也可导致眼部感染风险，还可引起心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。 研究显示，蜡样芽孢杆菌已从多种食物中分离到，具有腹泻型和呕吐型，并且致腹泻或呕吐具有地域性，欧洲、亚洲、美洲等不同地区各有其主要症状特点。 日常饮奶中，由蜡样芽孢杆菌引起的不适，也可能与乳糖不耐症有关（赵月明和任国谱，2014；刘绍军，2006）。 因此，牛奶中的芽孢杆菌是乳品质量安全的一个重要风险因子，应引起生产者、消费者、研究者等的重视和警觉。

2 热处理工艺对牛奶中芽孢杆菌的影响

热处理加工工艺是利用适当的设施设备，采用温度和时间的不同组合参数， 对原料乳进行杀菌， 达到奶产品食用安全的最常用的一种工艺方式。 热处理条件在理论上一般取决于生乳中微生物的数量和特性、脂肪或碳水化合物含量等。由于微生物耐热程度存在差异，不同国家对奶的热处理条件工艺要求、规定或标准不同。巴氏杀菌和超高温灭菌是最常见的两种热处理工艺， 巴氏杀菌热处理工艺一般采用64 ℃/30 min、75 ～85 ℃/15 s等工艺条件， 超高温灭菌热处理工艺通常采用135 ～150 ℃/1 ～4 s 等工艺参数。巴氏杀菌、高温杀菌、超高温灭菌等热处理工艺不同，所产生的杀菌效果不同，生产的奶产品特性、保质期、食用及保存要求等不同， 具体可参见表1 （张养东等，2020； 王加启等，2017； 张和平和张列兵，2012；Mortier 等，2000）。 由于实际生产工艺参数的设置和日常运行受多种因素影响， 要达到表1 中微生物学效应，热处理工艺条件必须保证设置准确、规范操作和定期严格校正， 避免引起热杀菌处理效果的不稳定。

表1 不同热处理条件对奶产品贮存条件及微生物效应的影响

2.1 巴氏杀菌 巴氏杀菌热处理工艺，能有效杀灭结核分支杆菌等致病微生物， 通过热处理降低奶及奶制品中微生物的数量， 使其对身体健康不产生危害（Codex Alimentarius Commission，2004）。巴氏杀菌工艺中，若出现热处理过度，会对奶的保存性产生不良影响， 易促使芽孢杆菌产的芽孢发生热应激而萌发生长，引起巴氏杀菌奶变质，进而降低巴氏杀菌奶质量和货架期。 仅就杀菌温度而言，通常认为杀菌温度小于77 ℃时，巴氏杀菌奶保存性能较好，乳过氧化物酶可保持活性，不易激活细菌芽孢生长（张养东等，2020）。

巴氏杀菌能杀死沙门氏菌、空肠弯曲菌、大肠杆菌、单核李斯特菌、肠炎杆菌和布鲁氏菌等，但不能杀灭病原菌芽孢 （Kelly 等，2012；Papademas等，2010）。但陈霞等（2011）研究也发现，巴氏杀菌与超高温灭菌协同工艺，经85 ℃/15 s 热处理后，37 ℃保温2 h，再经过135 ℃/4 s 处理，热致死率达99%，可有效提高奶中耐热芽孢的杀灭效率。

实际生产中， 用于生产巴氏杀菌奶的原料奶中，微生物指标有严格限制，一般要求高温灭菌，这是生产合格巴氏杀菌奶的前提。 蜡状芽孢杆菌的芽孢在低温下能够生长，可引起乳源性疾病。经严格巴氏杀菌热处理的奶不会引发疾病， 但如果热处理不当或者在巴氏杀菌后发生二次污染，奶产品中可能会出现沙门氏菌、单核李斯特菌等。另外， 巴氏杀菌奶中是否存在嗜冷菌及存在的数量取决于热处理前的初始菌数。因此，原料奶的微生物含量或者生乳的质量，是控制奶中微生物，特别是芽孢杆菌的基础和关键。

2.2 超高温灭菌 超高温灭菌是在高温下对连续流动的原料奶进行一定时间的热处理，使产品达到商业无菌（Codex Alimentarius Commission，2004），同时超高温灭菌和无菌包装需结合使用， 满足储运、携带和存放等条件。 超高温灭菌热处理的奶产品，在常温存贮条件下，微生物几乎不生长。

超高温灭菌能够杀灭所有的繁殖性细菌（病原菌和非病原菌）以及大部分芽孢细菌，因此，生乳的质量是影响超高温灭菌奶品质的关键因素。热处理对牛奶中耐热芽孢致死效果影响表明，耐热芽孢杆菌最适生长温度为37 ～42 ℃， 经121℃/10 min 和135 ℃/4 s 热处理后， 热致死率达58.08% ～71.43%（陈霞等，2011）。 Scheldeman 等（2006）研究发现，生乳中芽孢杆菌数量多，超高温灭菌处理后易出现残留风险， 耐热芽孢杆菌会产生强耐热的芽孢，而Touch 和Deeth（2009）发现芽孢从管道设备中彻底清除的难度较大， 导致乳制品生产隐形污染升高， 严重影响后期生产线运行和产品品质及质量。

超高温灭菌奶中出现的芽孢杆菌， 如嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌， 当奶的储藏温度低于30 ℃时处于不生长状态，但目前关于其存在原因是由于灭菌后污染， 还是其耐热未被杀灭存在一些争议。在超高温灭菌奶中，最常检测到的细菌有地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、栗褐芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌等， 研究表明蜡样芽孢杆菌经超高温灭菌处理后不可全被杀灭， 说明存在二次污染的可能，因此生产质控管理需引起重视（Touch 和Deeth，2009；Simmonds 等，2003）。

2.3 热抑菌 在乳品加工中也会设置热抑菌环节，也称预热杀菌环节。 热抑菌通常是在60 ～69 ℃条件下保持20 s， 主要目的是抑制细菌生长或者杀死不耐热微生物，尤其是嗜冷菌，从而防止产生耐热的脂肪酶和蛋白酶，影响奶的保存性能。热抑菌可延长生乳在加工前的贮藏时间， 提高奶的保存能力（Kelly 等，2012）。 预热杀菌与高温杀菌效果明显不同， 因其不能完全杀灭单增李斯特菌等奶中的病原菌， 对牛分枝杆菌等的杀灭作用也有限，在热抑菌后冷藏期间仍能生长，而无法保证奶的食用安全性（Ozer 和Akdemir，2015）。

2.4 热协同高压灭菌 热处理对奶中芽孢杆菌杀菌效果的研究中，不同条件及结果存在差异，研究发现热处理温度、 保持时间和超高压处理相协同， 对奶中菌落总数和大肠菌群有显著的杀灭效果，这种协同作用明显（沈梦琪等，2021；林向阳，2005； 邱伟芬和江汉湖，2001）。 德力格尔桑等（2007）研究了高压处理对鲜牛奶中枯草杆菌芽孢的致死效应， 结果显示，40 ℃条件下200 MPa 低压处理5 min，停压1 min，再升至700 MPa 下处理5 min，循环处理7 次，牛奶中枯草杆菌芽孢数减少到102～103cfu/mL。 沈梦琪等（2021）研究发现，生乳在600 MPa（20 ～30 ℃）处理15 min，保温30 min，菌落总数的致死率达100%。 与微生物繁殖体相比，细菌芽孢对高压的耐受能力较强，在1000 MPa 压力下仍可存活。内生孢子对高压的耐受能力更强，大于1000 MPa，温度高于80 ℃条件下才能完全灭活（刘成梅等，2006）。对热协同超高压不同介质中嗜热脂肪芽孢杆菌的灭活效果研究表明，在60 ～90 ℃条件下，500 ～600 MPa，保压5 ～30 min， 牛奶中芽孢杆菌的杀灭效果逐渐增强（武玉艳等，2009）。 因此，牛奶热处理杀菌工艺中，温度、时间以及压力是杀菌效果的关键技术参数（Fox 等，2015）。 如果完全杀灭芽孢杆菌，特别是杀死全部可能存在的芽孢，需要温度、时间和压力的有效协同组合。但郭利亚等（2020）研究发现，实际生产中，多次热处理、高压或超高压、多循环杀菌处理后，对牛奶的热损害程度增大，不良的物理化学反应增强，奶的潜在营养损失提高，与国际通行热处理工艺路线偏离， 因此该操作的适应性仍有待商榷。

3 对策与建议

生乳或原料奶的品质状况决定牛奶热处理工艺的选择（顾佳升等，2016；Fox 等，2015；顾佳升，2004）。而牛奶中的芽孢杆菌数量也取决于生乳质量， 特别是原料奶投料前的质控状态。 胡启桥（2000）研究认为，如果生乳中芽孢数过多，热处理后产品中将会残留。因此，控制生乳中芽孢杆菌数量， 是乳品芽孢杆菌防控的首要关键点（李建洲等，2020）。 特别是来源不能忽视， 芽孢杆菌广泛存在于自然环境中，包括土壤、空气、水和尘埃等，会污染食品及其原材料。 原料奶的污染来源主要是奶牛的粪便、饲料、水和土壤，还有奶罐和加工车间的机械管道。 对于芽孢杆菌， 热处理工艺只是杀菌的一个技术手段， 奶中是否存在芽孢杆菌及存在数量取决于热处理前的初始菌数（李忠民等，2013）。 所以，整个奶业生产链条运行中，需重视养殖场（区、户）或牧场作为牛奶生产“第一车间”对生乳品质的影响，特别是饲草料等投入品、饲养技术及管理、养殖环境卫生等，严格做好饲源因素的有效防控。

生乳中的微生物需要适宜的温度才能生长，控温是保持奶中微生物稳定和延长货架期的一个方法，但牛奶冷却并在低于4 ℃的条件下储存，也不能够抑制所有细菌的生长繁殖，特别是嗜冷菌，蜡样芽孢杆菌属于嗜冷菌且有致病性， 可形成孢子，其多种特性需要引起特别关注。 另外，目前一些乳品加工企业，通常只测定原料奶中细菌总数，检测原料奶中芽孢情况较少。对超高温灭菌产品，最重要的是原料奶中芽孢总数及耐热芽孢数。 芽孢杆菌及芽孢类别和数量的测定对生产具有重要指导意义。

因此，对于牛奶中芽孢杆菌的防控，饲草料、饲用饮水、饲养管理等饲源性，垫料卫生及场区消毒等饲养环境源性，冷储运及加工等设备源性，都需纳入防控范围， 综合建立防治评估体系和标准规范势在必行， 同时建议乳品生产加工企业建立完善检验检测制度，纳入产品考核监控指标，从牧场、工厂到市场全链条全面保障，切实筑牢乳品质量安全保护屏障。