鱼肠道和南太湖水样中乳酸菌分离、鉴定及抑菌分析

李艳洁， 张红芳， 吴酬飞，， 张立钦

（1.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000；2.湖州师范学院，浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室，浙江湖州 313000）

我国是世界水产品养殖大国，根据《2020 中国渔业统计年鉴》显示，2019 年我国水产品总产量达6480.36 万t，其中养殖产量5079.07 万t，淡水产品产量3197.87 万t。 在集约化养殖模式下，高密度养殖增加了水产品产量， 随之也导致养殖水体污染，生态环境破坏，水生动物疾病频频出现（杨耿介等，2021）。 由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的细菌性败血症，是危害鱼的种类最多、范围最大、流行地区最广、流行季节最长、造成经济损失最大的一类急性传染病 （Fernandez-Bravo 和Figueras，2020）。 由带有大量毒力因子的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）引起的细菌性疾病， 在水生生物个体免疫力低下或体表有创伤的情况下更容易被感染， 暴发时可造成较高的死亡率（ Li 等，2020）。 虽然抗生素的使用最快捷有效， 但随之产生的抗药性会影响水产养殖品种本身细菌感染的治疗， 并通过人畜共患病或将耐药性基因转移到人类， 增加人类抗生素耐药性的风险（Henriksson 等，2018）。 嗜水气单胞菌对四环素、卡那霉素、氨苄西林、呋喃妥因、喹诺酮类等多种抗生素耐药 （Preena 等，2020； 任亚林等，2019），维氏气单胞菌耐受氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、 青霉素G、 万古霉素、 克林霉素等药物（Prediger 等，2020；Tekedar 等，2020）。 为此，各种抗生素类药物替代品的研究如乳酸菌因可应用于水产动物体内和体外环境， 达到防治疾病和提高水产品质量的目的，具有替代抗生素的潜力（张静等，2020；Ringo 等，2018）。

大多数乳酸菌都能产生抗多种病原微生物的抗菌分子。 乳酸菌产生的主要抑菌物质包括有机酸、抗菌肽、过氧化氢等（Mbawala 等，2013）。 乳酸菌对于多种病菌均有抑菌作用， 孙梦桐等（2020）在鲤鱼肠道中筛选到的乳酸乳球菌LY3-1， 对哈维氏弧菌群体感应及生物膜的形成具有抑制作用。Kong 等（2020）在乌鳢的肠道分离到的粪肠球菌和乳酸乳杆菌对于维罗氏菌JL-8155、 嗜水气单胞菌ATCC 7966、 沙门氏菌ATCC 27013 有拮抗活性。Alonso 等（2019）在13 种海洋鱼类肠道中分离获得乳酸乳球菌乳酸亚种、肠球菌属、植物乳杆菌、 肠膜明串珠菌肠膜亚种， 其对于哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌、灿烂弧菌具有广谱抑菌性。

基于乳酸菌的广谱抑菌性， 本研究拟在鱼类肠道和南太湖水体中分离筛选乳酸菌菌株， 并以其对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的拮抗作用进行相关研究， 旨在以乳酸菌微生态制剂添加到水产养殖饲料中提升鱼类抗病力和免疫力。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 乳酸杆菌肉汤培养基（LBM）、MRS 肉汤培养基、革兰氏染色试剂盒、MR-VP 生化管、甲基红试剂盒、硫化氢生化管、明胶生化管、V-P 试剂盒： 青岛高科技园海博生物技术有限公司；琼脂：国药集团化学试剂有限公司；轻质碳酸钙（1250 目）：山东优索化工科技有限公司；胰蛋白胨、氯化钠、酵母浸提物、过氧化氢试剂、细菌基因组DNA 抽提试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备 叠加式恒温振荡箱（摇床）：苏州捷美电子有限公司；两槽式培养箱：重庆雅马拓科技有限公司；生物安全柜、PCR 扩增仪：力康生物医疗科技控股有限公司力新仪器（上海）有限公司； 立式灭菌器： 山东新华医疗器械股份有限公司；凝胶成像仪、电泳仪：美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 鱼： 在湖州市中心农贸市场随机购买鲜活的鲤鱼、鲫鱼、黄颡鱼、鳊鱼、太湖白鱼。 水样：在南太湖北纬30°57'、东经120°7'附近水域采集水样（表1）；在湖师院德清湖湖边采集水样，编号为DC。

表1 水样采集信息

1.3.2 菌液富集与筛选 在生物安全柜内无菌解剖鱼， 获取肠道称重后加入5 倍的生理盐水充分研磨制备菌悬液。 将鱼肠道菌悬液和10 mL 水样加入到乳酸杆菌肉汤培养基中，37 ℃、160 r/min培养24 h 至菌液完全浑浊， 使用0.9%生理盐水将菌液进行梯度稀释至10-5， 涂布在1%碳酸钙MRS 琼脂培养上，置于37 ℃培养箱倒置培养24 h，挑取有明显透明溶钙圈的菌落进行反复划线传代，直至镜检确认纯培养物。

1.3.3 形态学鉴定 提取上述纯菌落四区划线在MRS 琼脂培养基上，37 ℃培养24 h， 观察菌落形态。并进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行下一步试验。

1.3.4 生理生化鉴定 参照凌代文的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行生理生化鉴定。

1.3.4.1 过氧化氢酶试验 在载玻片上滴加新鲜配制的3% H2O2， 挑取菌落置于H2O2液滴中，观察30 s 内有无气泡产生，发生气泡为阳性，不发生气泡者为阴性。

1.3.4.2 明胶液化试验 取菌落穿刺接种在明胶培养基内，37 ℃培养48 h， 取出后放4 ℃冰箱30 min，如果内容物不凝固呈液态状，则为阳性，如内容物凝固不流动，则为阴性。

1.3.4.3 硫化氢试验 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物， 而产生硫化氢气体，H2S 会使培养基中的醋酸铅形成黑色的硫化铅。

1.3.4.4 甲基红MR 试验 取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR-VP）中，37 ℃培养24 h。 滴加甲基红试剂5 滴，立即观察结果。 鲜红色为阳性，黄色为阴性。

1.3.4.5 V-P 试验 提取3 ～5 个单菌落接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR-VP）中，37 ℃培养24 h，滴加V-P 试剂盒A 液0.6 mL（6 滴）与培养物充分混匀后，再添加B 液0.2 mL（2 滴）混匀即可。振摇试管后静置0.5 ～2 h。 观察结果阳性反应：伊红色；阴性反应：不变色或棕黄色。

1.3.5 16S rDNA 鉴定 使用细菌基因组DNA 抽提试剂盒提取细菌基因组DNA， 正向引物为27f（5'-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3'）， 反向引物 为 1492r （5' -TACGGY -TACCTTTGTTAC GACTT-3'）， 引物由上海生工生物技术公司合成。PCR 扩增反应体系为DNA 模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、 上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，总体积25 μL。PCR 扩增反应程序为，95 ℃变性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，循环35 次，4 ℃保温。

PCR 产物检测：预先制备1%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后， 取2 μL 的PCR 产物与2 μL 6×Loading buffer 混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳， 电压5 V/cm， 电泳液为1×TAE，25 min 后取出。 将扩增成功的PCR 产物送至擎科生物技术有限公司测序。 测序结果经校对后将分离得到的乳酸菌的16S rRNA 序列结果在NCBI 上进行Blast 相似性分析，选择同源性较高的菌株的16S rRNA 序列，以邻接法运用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.3.6 抑菌试验 维氏气单胞菌（GDMCC 1.893）和嗜水气单胞菌（ATCC 35654）购自广东省微生物菌种保藏中心。

菌液的制备：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌挑取单菌落接入LB 肉汤，28 ℃培养OD600至2.0；挑取乳酸菌单菌落接种于MRS 肉汤培养基，37 ℃培养OD600至2.0。

制作双层琼脂培养基：以8 mL 的MRS 琼脂为底，放置3 个牛津杯，待LB 琼脂培养基温度降至40 ～43 ℃时， 加入1%浓度的病原菌充分混匀，倒入MRS 琼脂上，待其凝固缓慢取出牛津杯。在牛津杯A 孔中加入100 μL 的无菌水作为阴性对照，B 孔中加入100 μL 的500 μL/mL 硫酸庆大霉素溶液作为阳性对照，C 孔中加入100 μL 的乳酸菌菌液，室温静置3 h 后将培养基正置于28 ℃培养箱，24 h 后观测抑菌圈大小， 并用游标卡尺测量。

2 结果与分析

2.1 分离筛选结果 经过富集培养和筛选，共筛选到5 株疑似乳酸菌菌株。 在鲤鱼肠道内分离到一株疑似乳酸菌，命名为L；在鲫鱼肠道内分离到一株疑似乳酸菌，命名为J；在太湖白鱼肠道内分离到一株疑似乳酸菌，命名为T；在太湖水样5-1中分离到一株疑似乳酸菌，命名为T5-1；在德清湖水样中分离到一株疑似乳酸菌，命名为DC2。

2.2 形态学鉴定结果 经过MRS 碳酸钙平板划线分离和革兰氏染色， 共得到5 株疑似乳酸菌菌株。 各菌株在MRS 碳酸钙平板上可形成3 ～5 mm 的透明溶钙圈，菌落呈乳白色或类白色，表面光滑湿润，边缘整齐。各菌株经革兰氏染色在显微镜油镜下均为G+：L 株呈短杆形， 菌株细胞单个排列，J 株呈圆球形，菌株细胞成对排列，T 株呈扁圆球形， 菌株细胞单个或成对排列，T5-1 株呈扁圆球形， 菌株细胞单个或成对排列，DC2 株呈不规则短棒状，菌株细胞成对排列。

图1 菌株L、J、T、T5-1、DC2 在MRS碳酸钙平板上形态及革兰氏染色结果

2.3 乳酸菌生化鉴定结果 对5 株乳酸菌进行过氧化氢酶试验、硫化氢试验、甲基红试验、明胶液化试验、V-P 试验五项生化鉴定， 结果见表2。由表2 可知， 菌株L、J、T、T5-1、DC2 的过氧化氢酶试验，硫化氢试验，V-P 试验为阴性；甲基红试验为阳性。 菌株L、J、T5-1、DC2 明胶液化试验为阴性，菌株T 明胶液化试验为阳性。

表2 各菌株的生理生化鉴定结果

2.4 16S rDNA 鉴定结果 以提取的纯化菌株基因组DNA 为模板， 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图如图2 所示。16S rDNA 扩增产物在1000 ～2000 bp ，产物的电泳条带单一且清晰，满足测序要求。将5 株菌株的测序结果与GenBank 中已知序列进行同源性比对，确定测序菌株的种属信息，结果见表3。

图2 乳酸菌PCR 产物电泳

表3 乳酸菌纯化菌株16S rDNA 鉴定结果

经MEGA 7.0 软件构建系统发育树如图3，菌株L 与Lactobacillus plantarum在同一分支，同源性达到100%，相似性为100%，可确定L 株为植物乳杆菌。 菌株DC2 与Weissella paramesenteroides在同一分支，同源性达到100%，相似性为100%，可确定DC2 株为类肠膜魏斯氏菌。 菌株T与Enterococcus faecalis在同一分支，同源性达到100%，相似性为100%，可确定T 株为粪肠球菌。菌株J 和T5-1 两者与Lactococcus lactis在同一分支，同源性达到100%，可确定J 和T5-1 株为乳酸乳球菌。

2.5 乳酸菌的抑菌能力 所分离到的乳酸菌对于两种病原菌均有一定的抑制效果， 在嗜水气单胞菌的平板上，100 μL 的500 μL/mL 硫酸庆大霉素溶液产生的抑菌圈大小平均为22.8 mm， 菌株J、T5-1、DC2、T、L 的 抑 菌 圈 大 小 分 别 为26、22、21、19、18 mm。在维氏气单胞菌的平板上，100 μL的500 μL/mL 硫酸庆大霉素溶液产生的抑菌圈大小平均为15 mm， 菌株L、DC2、J、T、T5-1 的抑菌圈大小分别为24、21、17、16、14 mm。

图4 乳酸菌发酵液对指示菌的抑制作用

3 讨论与小结

本次分离鉴定得到的菌种在水产养殖中大多有过相关报道：植物乳杆菌对鮰鱼爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌三种斑点叉尾鮰潜在致病菌具有较好拮抗作用， 具有较好的耐受胆盐能力， 对Caco-2 细胞具有一定的黏附作用（Mbawala 等，2013）。 在鲫鱼肠道内分离到的屎肠球菌对于维氏气单胞菌具有一定的抑制作用（Kong 等，2020）。 在斜带石斑鱼肠道分离到的乳酸乳球菌和粪肠球菌， 对嗜水气单胞菌、 溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌以及大肠杆菌5 种致病菌有抑制作用，抑菌直径为9.5 ～22.5 mm（Alonso等，2019）。在饲料中添加乳酸乳球菌JCM5805，可促进尼罗罗非鱼的生长， 提高饲料利用率和成活率，并能提高尼罗罗非鱼对于无乳链球菌的抗性；同时JCM5805 改善了尼罗罗非鱼肠道微生物群落构成，增加了肠道有益菌的存在，降低了潜在致病菌的分布并且能够在尼罗罗非鱼的肠道内增殖（Mao 等，2020）。在乌鳢肠道分离到的乳酸乳球菌和粪肠球菌，乌鳢经维氏气单胞菌攻击后，基础日粮中添加乳酸菌饲喂的乌鳢存活率显著增加（Kong 等，2020）。 类肠膜魏斯氏菌可发酵葡萄糖产生乳酸，常用于发酵泡菜酱油，在水产养殖中的应用较少。 本试验结果与以上研究中的植物乳杆菌、 粪肠球菌和乳酸乳球菌的抑菌拮抗效果基本一致。

乳酸菌除了具有抑菌活性， 还可作为疫苗的抗原载体，使用共表达SVCV 糖蛋白（G）和KHV ORF81 蛋白的基因工程植物乳杆菌作为口服疫苗，通过口服疫苗诱导鲤鱼的保护性免疫，可控制鲤鱼春季病毒血症和锦鲤疱疹病毒病 （Yao 等，2020）。在养殖对虾中添加乳酸杆菌可以改善养殖水质，提升对虾对白斑综合征病毒（WSSV）的抗病毒能力，增强对虾的免疫应答（Naiel 等，2021）。乳酸菌作为鱼类肠道中的益生菌， 对于鱼类生长发育、免疫抗病、维持肠道系统功能发挥着至关重要的作用。 本研究由动物肠道和南太湖水体中分离到的土著乳酸菌，添加至养殖饲料中，更具有同源性，更易于在鱼类肠道中定植和发挥益生作用。浓度为500 μL/mL 的庆大霉素对嗜水气单胞菌的抑菌直径为22.8 mm， 所分离到的两株乳酸乳球菌、类肠膜魏斯氏菌抑菌直径达26、22、21 mm，与抗生素效果基本一致，粪肠球菌、植物乳杆菌的抑菌直径为19、18 mm。 浓度为500 μL/mL 的庆大霉素对维氏气单胞菌的抑菌直径为15 mm，植物乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌的抑菌直径为24、21 mm，抑菌效果显著高于抗生素；乳酸乳球菌（J）、乳酸乳球菌（T5-1）、粪肠球菌的抑菌直径为17、14、16 mm，抑菌效果和抗生素基本一致。 抑菌圈虽然随着时间推移而变小， 但是到48 h 后仍有（10±2）mm 的抑菌圈， 表明乳酸菌菌液的抑菌时效性较长， 可为后续开发功能性水产养殖微生态饲料提供资源和参考。