响应面优化杂交构树叶黄酮提取工艺及对5 种禽病原菌的抑制作用

魏 磊， 景炳年， 王品胜， 高正龙， 谢晓阳， 陈谭星， 孟庆法， 王 伟

（1.河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，河南郑州 450002；2.河南省高新技术实业有限公司，河南郑州 450002；3.河南省科学院地理研究所，河南郑州 450052）

禽大肠杆菌病、 沙门菌病和葡萄球菌病是严重损害家禽生长的细菌性传染病， 具有常见性和高发性，主要包括气囊炎、脑膜炎、脐炎、败血症、伤寒、肠炎、白痢、化脓性关节炎、各脏器严重感染等症状 （吴陈俊，2021； 商春颖，2020； 何松芳，2017），是由禽致病性细菌如大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌等引起，给家禽产业造成严重的经济损失，同时也严重威胁着禽产品消费者的健康安全。 使用抗生素可有效改善这些症状， 但会在动物体内及其制品中残留从而直接威胁人类健康， 尤其长期低剂量地在饲料中进行添加更易产生耐药性的超级细菌（王云鹏等，2008）。因此在饲料及饲料添加剂行业寻找安全、高效、稳定、易得的抗生素替代品迫在眉睫。天然植物及其提取物以其资源丰富、来源广泛、毒副作用低、残留少和不易产生耐药性等独特优点作为饲料或饲料添加成分备受青睐（刘华等，2020；Mulat 等，2019）。

研究表明， 沙棘黄酮可提高饲料中蛋白质和钙的利用率，提高肉鸡胴体品质（李垚等，2008）。艾叶黄酮可提高肉鸡小肠抗氧化能力， 抑制肠道内产酸克雷伯菌生长（Wan 等，2016）。 青蒿黄酮可提高肉鸡血清中抗氧化酶活性， 降低丙二醛的含量（Zhao 等，2016）。 槲皮素可促进IgY 抗体分泌， 提高肉鸡免疫性能 （Hager-Theodorides 等，2014）。黄芩黄酮对鸡大肠杆菌和鸡白痢具有明显的体内抑菌作用, 并对人工诱发的鸡大肠杆菌病和鸡白痢有明显的防治效果（梁英等，2007）。 总之， 植物黄酮作为饲料添加成分进行研发应用的前景广阔。

构树（Broussonetia papyrifera），为桑科构树属多年生落叶乔木或灌木。 构叶以其蛋白质含量丰富，适口性好，成为猪、牛、羊、鸡等畜禽养殖的新型饲料（邳植等，2018），含有的天然活性成分主要为黄酮和多糖等物质。 杂交构树是中国科学院通过野生构树杂交和太空搭载等技术手段培育出的构树新品种。相较普通构树，杂交构树蛋白质含量更高、纤维素含量更低、生长快耐刈割（黄炎坤等，2020）。 2015 年杂交构树产业被评为国家十大精准扶贫项目之一。 目前仅有杂交构树树皮黄酮对真菌抑制作用研究（开伟华等，2015）及普通构树叶黄酮和根黄酮对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和弧菌的抑制作用研究（徐梦宇等，2011； 李万仓，2008），针对杂交构树叶片黄酮的响应面结合超声波辅助提取工艺优化及其对禽主要致病菌的抑制作用鲜见报道。

因此， 本文结合响应面法和超声波法优化杂交构叶黄酮的乙醇提取工艺， 并检测杂交构叶黄酮对5 种禽致病菌即鸡源大肠杆菌、 鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鸡源金黄色葡萄球菌的抑制作用， 旨在为杂交构叶黄酮开发为天然植物饲料添加成分及加速杂交构叶资源的综合开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 构叶为中国科学院植物研究所培育的两年生杂交构树“科构101”叶片，采自河南省开封市兰考中科华构生物科技有限公司生产基地，阴干后粉碎备用；禽致病菌包括：鸡源金黄色葡萄球菌CVCC 548、 鸡源大肠杆菌CVCC 1555、鸡白痢沙门菌CVCC 1887、鼠伤寒沙门菌CVCC 3384、鸡伤寒沙门菌QAU 0320，购自中国兽医药品监察所；芦丁，购自中国药品生物制品检定所；牛肉浸膏，购自北京双旋微生物培养基制品厂；胰蛋白胨，购自上海保录生物科技有限公司；96 孔板，购自美国Corning 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 杂交构叶黄酮提取 称定1.00 g 杂交构叶粉，倒入100 mL 三角瓶中，加入一定料液比、一定浓度乙醇溶液，在一定温度下超声一定时间，重复提取3 次，滤液合并后于旋转蒸发仪上浓缩，定容至25 mL， 取20 μL 进行黄酮浓度和含量的测定。

1.2.2 芦丁标准曲线绘制及黄酮含量测定 以芦丁为标准品，采用分光光度法测定黄酮含量。纵坐标为吸光度（A），横坐标为芦丁质量浓度（C），绘制标准曲线，求得回归方程。根据回归方程计算提取液黄酮含量。 黄酮提取得率计算公式为：

提取得率/%=黄酮质量浓度×提取液体积×稀释倍数×100/杂交构叶质量。

1.2.3 杂交构叶提取黄酮单因素试验及响应面设计 单因素试验包括乙醇浓度（A） 、料液比（B） 、超声温度（C）和超声时间（D）四个独立试验，再根据Box-Behnken 试验设计原理，按照Design-Expert 8 软件安排29 组试验并对结果进行分析，得到杂交构叶黄酮提取优化方案。 试验设计因素水平和29 组试验结果分别见表1 和表2。

表1 因素与水平

表2 响应面试验设计方案和结果

1.2.4 杂交构叶黄酮制备工艺 按照上述响应面优化后的提取工艺提取杂交构叶黄酮， 抽滤浓缩至一定体积后加入该体积2 倍的无水乙醇， 低温静置24 h 去除多糖后真空冷冻干燥，即得杂交构叶黄酮样品。

1.2.5 杂交构叶黄酮对禽致病菌抑制作用

1.2.5.1 菌悬液制备 5 种禽致病菌37 ℃摇床复苏后接种于固体培养基上， 过夜培养后挑取单个菌落混悬于液体培养基中， 使用麦氏比浊仪检测菌液浓度， 将各菌株调制成106～108CFU/mL 的菌悬液。

1.2.5.2 最小抑菌浓度（MIC）测定 MIC 采用二倍稀释法进行测定。将1.2.4 项下杂交构叶黄酮配制成400 mg/mL 母液后用0.22 μm 滤膜过滤，再依次倍比稀释9 个浓度，依次为200、100、50、25、

12.5 、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL。 将10 个浓度梯度黄酮药液各100 μL 分别加入96 孔板中， 再分别加入100 μL 1.2.5.1 项下制备好的各种菌悬液。 阳性对照加入100 μL 菌悬液和100 μL液体培养基，阴性对照加入200 μL 液体培养基。96 孔板加盖密封后37 ℃培养过夜，观察结果，无菌生长的最小浓度为MIC 值。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线 以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线， 得到芦丁标准曲线方程为A=0.2608C-0.0276，R2=0.9985，线性关系良好， 结果如图1 所示。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度 当料液比1：20 g/mL、 超声温度30 ℃、时间20 min 时，考察乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%） 对杂交构叶黄酮提取得率的影响，结果如图2A。在乙醇浓度为60%时得率最大，根据相似相溶原理推测杂交构叶黄酮极性与60%乙醇相似，故最佳乙醇浓度为60%。

2.2.2 料液比 当乙醇浓度60%、超声温度30 ℃、时间20 min 时， 考察料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）对杂交构叶黄酮提取得率的影响，结果如图2B。 得率随提取试剂体积增加而升高，在料液比为1:50 g/mL 时达到最大， 因此选择最佳料液比为1:50 g/mL。

2.2.3 超声温度 当乙醇浓度60%、料液比1:50 g/mL、 超声时间20 min 时， 考察温度（20、30、40、50、60 ℃） 对杂交构叶黄酮提取得率的影响，结果如图2C。40 ℃时得率最高，50 ～60 ℃时得率下降， 推测温度过高会影响黄酮分子结构稳定性而发生转化或降解，因此选择40 ℃为最佳提取温度。

2.2.4 超声时间 当乙醇浓度60%、料液比1:50 g/mL、超声温度40 ℃，考察提取时间（20、30、40、50、60 min）对杂交构叶黄酮提取得率的影响，结果如图2D。 得率随时间延长而升高，30 min 达到最大，此后略有下降。推测超声时间延长会增加杂质溶出，降低提取效果，故选择30 min 为最佳超声时间。

图2 乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声温度（C）、超声时间（D）对杂交构叶黄酮提取得率的影响

2.3 响应面试验结果 采用Design-Expert 8 软件对表2 数据进行分析， 求得拟合回归方程：Y=1.69118 +0.045317A -0.13675B +0.12140C -0.13302D-0.080900AB-0.031100AC+0.023600AD-0.072550BC-0.15110BD-0.13500CD-0.34897A2-0.24237B2-0.31140C2-0.12105D2。 对拟合模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型系数检验

由表3 可知，模型P＜0.0001，差异极显著（P＜0.01）。 决定系数R2=0.9632，说明96.32%的杂交构叶黄酮提取得率变化符合该模型， 模型拟合程度良好，表明该试验模型成立。 信噪比Adeq Precision 为15.462，远大于4，说明方程的拟合度和可信度较高，试验误差较小。 由各因素F 值可知四个因素对杂交构叶黄酮提取得率影响显著性顺序为料液比（B）＞超声时间（D）＞超声温度（C）＞乙醇浓度（A），B、C 和D 之间交互作用极显著，A与B、C、D 之间交互作用不显著，表明杂交构叶多糖提取得率与各因素间不单单是线性关系。 失拟项P值0.1030 ＞0.05，不显著，表明模型与具体试验结果吻合程度高。 因此该模型可对杂交构叶黄酮提取得率进行预测和分析。

利用Design-Expert 8 软件作出响应面图，如图3 所示。 响应面均开口向下，存在极高值。 响应面坡度陡峭程度反映交互作用强弱，越陡峭，表明响应值对因素改变越敏感， 反之影响越小（张爽等，2015）。 图3 直观反映了各因素交互作用对响应值的影响，料液比和超声时间、超声温度和超声时间交互作用曲面陡峭， 表明其对杂交构叶黄酮提取得率交互作用明显。

图3 两因素交互作用对杂交构叶黄酮提取得率影响的响应面图

用响应面软件得出杂交构叶黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度60.8%，料液比1：48.6 g/mL，超声温度33.5 ℃，超声时间23.5 min，在此预测工艺条件下，黄酮提取得率为1.77%。为便利试验操作修正为：乙醇浓度60%，料液比1：49 g/mL，超声温度34 ℃，超声时间24 min，在此条件下重复3 次试验，得到杂交构叶黄酮平均提取得率为1.75%，达到预测值的98.87%，说明应用响应面法优化杂交构叶黄酮的超声辅助提取工艺模型有效， 参数可靠，具有一定参考价值，为杂交构叶黄酮的深度开发提供理论依据。

2.4 抑菌试验结果 杂交构叶黄酮对5 种禽致病菌抑制作用结果见表4。 对所选5 种禽致病菌的MIC 为6.25 ～50 mg/mL，最低杀菌浓度（MBC）为杀死99.9% （降低3 个数量级）的供试菌种所需的最低药物浓度，其范围为12.5 ～100 mg/mL，整体抑菌作用较强， 尤其是对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌抑制作用最强。

表4 杂交构叶黄酮对5 种禽致病菌MIC和MBC 检测结果

3 讨论与结论

本研究通过响应面法对杂交构叶黄酮超声辅助提取工艺进行了优化，对乙醇浓度，料液比，超声温度，超声时间进行了单因素试验，得出杂交构叶黄酮提取的最优工艺参数为乙醇浓度60%，料液比1：49 g/mL，超声温度34 ℃，超声时间24 min，在此条件下，杂交构叶黄酮提取得率为1.75%，试验误差小，说明所得优化提取工艺参数可靠性高。朱开梅等（2011）采用微波辅助提取结合正交法优化提取构叶黄酮， 其最佳工艺为提取温度45 ℃，时间15 min， 料液比1：10 g/mL， 微波功率350 W，此条件下，黄酮提取量为1.39 mg/g（相当于提取得率0.139%），该工艺的提取效率低于本试验。而楚芳冰等（2015）采用超声辅助提取结合正交法优化提取构叶黄酮，确定的最佳工艺为料液比1：30 g/mL，超声时间40 min，乙醇浓度50%，温度50 ℃，此条件下黄酮提取得率可达4.01%，高于本试验。 由此可见，不同方法、构树品种、产地、树龄及采摘季节都会影响黄酮类物质在体内的生成和积累， 应深入研究变化规律才能在最佳时节采收。

目前， 在雏鸡和青年鸡阶段多数养殖场使用大量抗生素，控制传染性细菌病的发生，但忽视对传染源和传播途径的综合防控， 最终导致致病菌对常规抗生素的敏感性降低，耐药性加大，药物治疗效果变差，养殖成本增加。本研究中杂交构叶黄酮对5 种重要致病菌的抑制作用由强到弱分别为：金黄色葡萄球菌MIC=6.25 mg/mL、鼠伤寒沙门菌MIC=12.5 mg/mL、大肠埃希菌MIC=25 mg/mL、鸡白痢沙门菌MIC=25 mg/mL、 鸡伤寒沙门菌MIC=50 mg/mL，整体抑菌效果显著，作为鸡饲料添加成分防治传染性细菌病前景广阔。 本研究为杂交构叶黄酮类物质开发为饲料添加成分的进一步研究与应用提供理论参考。