牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的表征与分析

李墨翰，张秀敏，王亦宁，陈佳丽，热罕古丽，于海坤，张 娟，宋婉莹，刘爱成，岳喜庆,*，郑 艳,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.北京食品科学研究院，北京 100068；3.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

乳脂肪球膜的形成与乳脂的分泌过程密切相关，在乳脂肪球从乳腺细胞释放到乳汁的过程中，乳脂肪球会穿过细胞膜并被三层磷脂包裹，而这三层磷脂层则被称为乳脂肪球膜。乳脂肪球膜特殊的分泌过程可以收集哺乳动物母体细胞表面的膜结合蛋白、碳水化合物和脂质并将其转移到乳汁中，为哺乳动物新生儿提供营养。同时，乳脂肪球膜还是一种异质膜，其作为乳化剂可以防止乳脂肪球之间的相互融合与降解。乳脂肪球膜蛋白仅占乳中总蛋白质的5%左右，但却包含多种具有生理功能的蛋白质，在哺乳动物新生儿生长发育过程中起到重要的作用。

此前鉴定到的牛乳乳脂肪球膜中的蛋白主要有乳黏附素、黏蛋白-1、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶、脂肪酸合酶、脂肪酸结合蛋白等，这些蛋白在乳脂肪球膜蛋白中占有很大比例，同时还有大量的乳脂肪球膜蛋白有待表征。研究表明，泌乳期对乳中的蛋白质、氨基酸、脂质等营养成分存在显著影响。然而，针对不同泌乳期牛乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的表征与分析十分有限。

因此，本研究选定牛初乳和牛常乳中的乳脂肪球膜蛋白作为研究对象，利用定量蛋白质组学技术对其中的蛋白质进行表征，并对两组间的乳脂肪球膜丰度差异蛋白进行筛选及生物信息学分析。研究结果将有助于了解泌乳期间乳蛋白成分的差异及其功能性，为牛乳制品的精深加工奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品均采集于辽宁省沈阳市沈北新区某牧场（123.59°E，41.93°N），牛初乳与牛常乳样品分别采自45 头中国荷斯坦奶牛（），所选取的奶牛标准为：年龄1～2 岁、首次分娩、体质量500～600 kg、饮食与饲养条件一致。牛初乳选自分娩后0～1 d的奶牛，牛常乳选自分娩后30～40 d的奶牛。采集后的牛初乳与牛常乳样品置于干冰中运输并保存于超低温冰箱（-80 ℃）。实验前为排除个体差异，将45 份牛初乳样品随机分成3组，每组15 份样品进行充分混合，牛常乳样品同处理。

三羟甲基氨基甲烷（CAS登录号：77-86-1）、十二烷基硫酸钠（CAS登录号：151-21-3）、尿素（CAS登录号：57-13-6）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT，CAS登录号：3483-12-3）、胰蛋白酶（CAS登录号：9002-07-7）、碘乙酰胺（CAS登录号：144-48-9）、甲酸（CAS登录号：64-18-6）、乙腈（CAS登录号：75-05-8）、丙酮（CAS登录号：67-64-1）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 德国默克公司；超滤离心管（10 kDa）、超滤膜（10 kDa）、C过滤柱 美国密理博公司。

1.2 仪器与设备

HX-20TL型恒温混匀器 上海沪析实业有限公司；YTLG-12A型真空冷冻干燥机 上海叶拓科技有限公司；HH-4型恒温水浴锅、JC-GGC6000型振荡器 青岛聚创设备有限公司；EK-5000 EDI型超纯水系统 深圳伊科赛尔环保科技有限公司；Easy nLC型色谱系统、Q-Exactive型质谱仪、F3型微量移液器、Nano Viper型C预柱（2 cm×100 μm，5 μm）、Easy A2型C分离柱（10 cm×75 μm，3 μm） 美国赛默飞世尔科技公司；1-16型高速离心机 美国希格玛公司；Centrivap型真空离心浓缩仪 美国拉康科公司；M60X型紫外-可见分光光度计 德国菲索公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪球膜蛋白的提取

取5 mL乳样离心（10 000 r/min、15 min、4 ℃）以提取乳脂肪球，吸取上层乳脂肪球并加入5 倍体积的PBS，超声（100 W、3 min，重复3 次）以洗去可溶性蛋白，小心吸取并去除上清液。随后向其中加入10 倍体积的丙酮，并在暗房内静置12 h以沉淀蛋白。收集静置12 h后的混合物，在离心后（10 000 r/min、30 min、4 ℃）弃除上层液体并超声（100 W、3 min，重复3 次），即得到乳脂肪球膜蛋白。

1.3.2 胰蛋白酶解

胰蛋白酶是蛋白质组学研究中最常用的蛋白酶，可以高效、特异地切割蛋白质/多肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基端。由于赖氨酸和精氨酸在蛋白质序列中分布较广，蛋白质样品经胰蛋白酶消化后可产生平均长度为14个氨基酸残基并以碱性氨基酸结尾的肽段。这些肽段的羧基端赖氨酸或精氨酸残基上以及氨基端分别带一个正电荷，使得它们在离子阱中碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）时产生b、y类型（y离子为主）的离子碎片，便于被质谱有效检测。因此，本实验选取胰蛋白酶进行酶解，具体方法如下：取500 μg乳脂肪球膜蛋白，向其中加入150 mmol/L的DTT并孵育（90 ℃、100 min），待冷却至25 ℃时，加入UT缓冲液（150 mmol/L三羟甲基氨基甲烷和10 mmol/L尿素），在暗房中静置30 min后使用超滤离心管进行过滤，向其中加入UT缓冲液与碘乙酰胺，并在暗房中静置60 min。随后将混合物离心（10 000 r/min、30 min、4 ℃），按照1∶40比向其中加入胰蛋白酶缓冲液（胰蛋白酶与PBS体积比为1∶8）并置于暗房中消化（37 ℃，12 h）。消化后使用超滤膜对混合物过滤并离心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），并使用C过滤柱对其脱盐。最后将样品冻干并重新溶解于甲酸中（50 μL、0.1%）。

1.3.3 液相色谱-串联质谱分析

液相色谱参数设置参照本实验室此前条件。液相色谱条件：0～110 min，100.0%～45.0% I、0.0%～55.0% II；110～115 min，45.0%～0.0% I、55.0%～100.0% II。流动相I为99.80%去离子水-0.20%甲酸，流动相II为15.80%去离子水-0.20%甲酸-84.00%乙腈。乳脂肪球膜蛋白样品经预柱后由C分离柱进行分离（200 nL/min）。

质谱条件：电压2 kV，测量扫描分辨率70 000，范围为/350～1 800。离子自动增益控制设置为1×10，最长隔离时间为50 ms，动态排除操作为60 s，MS活化类型设置为HCD模式，所选择/2，/200处分辨率为175 000，标准化碰撞能量30 eV，最小填充率0.1%。随后使用MaxQuant对数据进行无标记定量分析。

1.3.4 统计与生物信息学分析

使用检验和差异倍数（fold change，FC）值筛选两组之间的乳脂肪球膜丰度差异蛋白，FC定义为某种蛋白在牛初乳中的丰度平均值与其在牛常乳中的丰度平均值的比值，牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的筛选阈值为：＜0.05且|FC|＞2.00。使用基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），注释、可视化和集成发现数据库（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）对牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的潜在功能及其参与的代谢通路进行生物信息学分析。使用STRING分析牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白间的蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络。

2 结果与分析

2.1 牛初乳与常乳乳脂肪球膜蛋白的表征

在牛初乳和常乳的乳脂肪球膜中共鉴定到763种蛋白质，其中197种蛋白在6组中均被检测到（图1A）。图1B显示了上述197种蛋白的分子质量，可以看到77种（占比39%）乳脂肪球膜蛋白的分子质量为10～30 kDa，49种（占比25%）乳脂肪球膜蛋白的分子质量在30～50 kDa。非标记定量（label-free）蛋白质组学技术是通过液相色谱-质谱联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，该技术不需要使用昂贵的稳定同位素标签作内标，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行定量，也广泛应用与乳脂肪球膜蛋白的表征和鉴定。此前，Liao Yalin等利用label-free蛋白质组学技术表征了不同泌乳期母乳的乳脂肪球膜蛋白并最终鉴定到191种蛋白；Lu Jing等使用label-free蛋白质组学技术对母乳、牛乳、山羊乳和牦牛乳中的乳脂肪球膜蛋白进行表征，并分别鉴定到312、554、175种和143种蛋白；Ma Ying等采用label-free蛋白质组学技术在牛乳和山羊乳中分别发现了632种和137种乳脂肪球膜蛋白；本实验室此前采用label-free蛋白质组学技术对驴初乳及常乳中的乳脂肪球膜蛋白进行了鉴定，并分别鉴定到216种和215种蛋白。本研究鉴定到的乳脂肪球膜蛋白将丰富对于不同泌乳期牛乳脂肪球膜蛋白成分的了解与认识，为牛乳脂肪球膜蛋白的加工与利用提供基础。

图1 牛初乳与常乳乳脂肪球膜蛋白的表征Fig. 1 Characterization of milk fat globular membrane proteins in bovine colostrum and mature milk

2.2 牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的筛选

图2 牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的筛选Fig. 2 Screening of differentially abundant proteins in fat globule membranes of bovine colostrum and regular milk

牛初乳与常乳的乳脂肪球膜中存在大量相同的蛋白，但其丰度却不尽相同（图2A），而这些蛋白含量变化的差异有可能是营养需求的关键。因此，本研究锚定在牛初乳与常乳的乳脂肪球膜中均鉴定到的共有蛋白，并设置阈值以从其中筛选乳脂肪球膜丰度差异蛋白。如图2B所示，本研究设置的阈值标准为＜0.05且|FC|＞2.00。最终筛选到80种乳脂肪球膜丰度差异蛋白，包括41种上调蛋白和39种下调蛋白（图2C和表1）。其中，乳过氧化物酶（Uniprot编号P80025）、糖蛋白2（Uniprot编号F1N726）、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（Uniprot编号F1MUT3和P80457）、5’-核苷酸酶（Uniprot编号Q05927）、硒蛋白F（Uniprot编号A8YXY3）等蛋白已在此前文献中报道，为乳脂肪球膜中的主要蛋白。

表1 牛初乳与常乳乳脂肪球膜中的丰度差异蛋白Table 1 Differentially abundant proteins in fat globule membranes between bovine colostrum and mature milk

续表1

2.3 牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的GO富集分析

图3 牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的GO富集分析Fig. 3 GO enrichment analysis of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

GO功能注释可分为分子功能、生物过程和细胞组成三大类，蛋白质或者基因可以通过对应序列号或者序列注释进行GO分析，从而了解其潜在的生理功能或细胞定位。如图3所示，上述80种牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中的丰度差异蛋白可能参与的条目包括细胞外泌体、细胞外空间、细胞外区域、细胞质、血液微粒、转运活性、顶端质膜、氧化还原过程、内质网等。研究表明，羊乳初的乳脂肪球膜中表达的急性炎症反应、先天性免疫应答等在GO功能注释中的富集数量要多于羊常乳。与该结果相似，本实验在急性炎症反应、先天性免疫应答GO功能注释中富集到的蛋白也存在显著差异，包括巨噬细胞迁移抑制因子（Uniprot编号A0A0F7RPX0）、膜辅因子蛋白（Uniprot编号G3MWX4）、免疫球蛋白J链（Uniprot编号Q3SYR8）、结合珠蛋白（Uniprot编号G3X6K8）等。利用蛋白质组学技术结合GO功能注释分析，本实验找到了一些与急性炎症反应、先天性免疫应答等重要过程相关的乳脂肪球膜丰度差异蛋白，这些蛋白的在泌乳期间的丰度变化为哺乳动物不同生长发育阶段提供了特定的保护。此外，细胞外泌体、细胞外空间、细胞外区域是大部分丰度差异蛋白所参与的细胞组分，同时也在此前关于乳蛋白在泌乳期间的变化研究中鉴定到。细胞外囊泡是蛋白质、信使RNA、MicroRNA和脂质运输完成细胞间通讯通路的重要媒介，根据它们的大小和发生分为3 类，包括外泌体、微泡和凋亡小体。其中，外泌体是直径大约为30～120 nm的微型囊泡，它们包含其起源细胞的某些成分，包括蛋白质和核酸等，并广泛存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中。外泌体可通过萌芽进入多囊泡体（multivesicular bodies，MVB）的内腔而形成，并通过MVB与顶端质膜融合从而释放到细胞外液中，并参与行使某些关键生理功能。研究表明，牛乳中含有大量的异质细胞群，包括乳汁分泌细胞、肌上皮细胞、前体祖细胞和干细胞等。因此，这些丰度差异的乳脂肪球膜蛋白很可能由乳腺肌上皮细胞等分泌，并参与细胞外囊泡的形成，然后进入乳汁。然而，上述乳脂肪球膜丰度差异蛋白以何种方式参与细胞外囊泡的形成，以及其所具有的生理功能仍有待进一步研究。

2.4 牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的KEGG富集分析

图4 牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

如图4所示，对上述乳脂肪球膜丰度差异蛋白进行KEGG富集分析后，可以看到参与的代谢通路主要有代谢途径（KEGG编号bta01100）、嘌呤代谢（KEGG编号bta00230）、苯丙氨酸代谢（KEGG编号bta00360）、酪氨酸代谢（KEGG编号bta00350）、丙酮酸代谢（KEGG编号bta00620）、糖酵解/糖异生（KEGG编号bta00010）、癌症的中心碳代谢（KEGG编号bta05230）、氨基酸的生物合成（KEGG编号bta01230）、过氧化物酶体（KEGG编号bta04146）、阿米巴病（KEGG编号bta05146）、胰高血糖素信号通路（KEGG编号bta04922）、碳代谢（KEGG编号bta01200）、蛋白聚糖在癌症中（KEGG编号bta05205）、肌动蛋白细胞骨架的调节（KEGG编号bta04810）、细胞因子与细胞因子受体的相互作用（KEGG编号bta04060）。丙酮酸代谢是能量代谢途径中的关键节点之一，在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸是糖酵解的终产物，也是糖异生的起点，且可以由转氨作用生成。丙酮酸脱氢酶复合物可将丙酮酸转化为乙酰辅酶A并进入三羧酸循环，或作为长链脂肪酸、类固醇和酮体合成的起点。研究表明丙酮酸还在平衡生物体内能量需求方面发挥着关键作用：在限制氧气供应或在线粒体缺乏的情况下，由糖酵解产生的还原型辅酶I的再氧化不能与ATP的产生相耦合。相反，再氧化与丙酮酸还原为乳酸相结合，乳酸被释放到血液中后主要被肝脏吸收，并被氧化成丙酮酸用于糖异生作用。此外，泌乳期间丙酮酸代谢的差异也在其他研究中得到印证，进一步说明了其在哺乳动物生长发育阶段的重要作用。

2.5 牛初乳与牛常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的PPI分析

图5 牛初乳与常乳乳脂肪球膜中丰度差异蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络Fig. 5 Protein-protein interaction network of the differentially abundant proteins in milk fat globule membranes of bovine colostrum and mature milk

对上述乳脂肪球膜丰度差异蛋白进行PPI分析，可以看到31个丰度差异蛋白间存在相互作用，并由此形成42 条相互作用（图5）。其中结合珠蛋白（Uniprot编号G3X6K8）与2-磷酸--甘油酸水解酶（Uniprot编号F1MB08）与其他蛋白存在最多的相互作用条数（均为8 条）。结合珠蛋白能够在血浆中与游离血红蛋白结合形成稳定的复合物，从而避免游离血红蛋白对肾小管的损害，随后结合珠蛋白-血红蛋白复合物被脾脏中单核细胞、巨噬细胞表面的血红蛋白清除受体（CD163）识别并结合，最后被吞噬降解。研究表明乳中的结合蛋白含量与母体的炎症及免疫反应密切相关，而其与乳中其他蛋白质的相互作用，以及其对哺乳动物新生儿的免疫调节作用仍有待进一步研究。

3 结 论

本研究利用蛋白质组学技术对牛初乳及常乳乳脂肪球膜蛋白进行表征，共鉴定到763种蛋白质，其中197种蛋白为共有蛋白。随后对牛初乳与常乳中的乳脂肪球膜中的丰度差异蛋白进行筛选，共筛选到80种乳脂肪球膜丰度差异蛋白，包括41种上调蛋白和39种下调蛋白。生物信息学分析表明这些乳脂肪球膜丰度差异蛋白主要参与了细胞外泌体、细胞外空间、细胞外区域等细胞组成，并参与了代谢途径、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、丙酮酸代谢等代谢通路。随后利用蛋白质互作网络进行分析，为深入了解牛乳乳脂肪球膜蛋白组成及其功能奠定基础。