线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因变异对绵羊产羔数的影响及遗传学分析

吕世琪，马晓菲，李 兵，贾春晖，王艳超，田树军，周荣艳，陈晓勇*

(1.河北农业大学动物科技学院，保定 071000； 2. 河北唯尊养殖有限公司，衡水 053900；3. 饶阳县农业农村局，衡水 053900)

产羔数是绵羊重要的经济性状之一，长期以来绵羊繁殖性状研究主要集在染色体核基因变异及其遗传效应，其中作为绵羊的多胎主效应基因研究较为广泛，母羊多胎性状遗传力为0.1～0.3，可以通过选择表型和基因型从而提高母羊产羔率。但已有研究发现，在小尾寒羊体内不携带基因突变的母羊仍可以观测到较高的胎产羔数，由此推断还存在其他的多羔效应基因。随着动物遗传学和生物技术的快速发展，已有研究表明线粒体基因变异影响畜禽经济性状，如奶牛的产奶性能、繁殖性能、屠宰性能，肉牛的生长和肉品质，猪的繁殖性能和肉品质。线粒体在能量代谢、凋亡、分化、信号转导等方面起着关键的作用，最近研究发现线粒体基因单倍型会影响牛的生理代谢性状、鸡和猪的能量代谢。Reicher等研究报道，绵羊线粒体基因变异与繁殖力相关。Wang等发现，线粒体基因多态性与猪的产活仔数有关。2020年，Liu等利用转线粒体细胞模型证实了线粒体基因变异影响猪产仔数。

线粒体基因组具有母系遗传特性，通过卵细胞将遗传信息传给子代，子代线粒体基因组均来自母本。本团队前期研究发现，小尾寒羊线粒体-(T7719G)基因变异与产羔数显著相关，该基因变异对以小尾寒羊为母本的杂交后代羊群产羔数的影响尚未见报道。在我国北方地区，常以小尾寒羊为母本进行生产实践的杂交，因此开展以小尾寒羊为母本的二元杂交羊群线粒体-(T7719G)基因变异遗传分析，将有利于辅助提高产羔数，为提高羊群选育质量提供分子选种手段。此外，已有研究指出季节和胎次是影响绵羊产羔数的重要因素。为此，本研究以小尾寒羊为母本的杂交羊群为研究对象，分析线粒体-(T7719G)基因变异对产羔数的影响，并将其与季节、胎次作为变量进行了遗传学分析，旨在探索-(T7719G)变异基因作为分子标记提高胎产羔数的可行性，为绵羊分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

1.1.1 试验动物 试验羊来自河北唯尊养殖有限公司种羊场，选择以小尾寒羊为母系的健康适龄繁殖母羊173只，共551次产羔记录。

1.1.2 主要试验试剂 血液基因组柱式小量提取试剂盒(康为世纪)、2×Taq PCR MasterMix(博迈德)。

1.1.3 引物设计 根据绵羊线粒体基因组序列(GenBank：AF010406)设计覆盖绵羊线粒体基因组序列的引物：上游引物：5′-CTACGGTCAATGCTCAGAA-3′，下游引物：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′，该引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 血样采集与DNA提取 通过颈静脉进行采血，新鲜血液暂存于含有柠檬酸钠抗凝剂的离心管中，做好羊号标记，迅速运回实验室进行DNA提取。血液若需长时间保存，应放于-80 ℃环境内。使用血液基因组柱式小量提取试剂盒进行DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2 PCR测序检测变异 PCR扩增反应体系(25 μL)：Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddHO 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃总延伸5 min。 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其中电泳电压为100 V，电流为100 mA，时间为30 min。利用PCR产物进行测序，分析鉴定基因型。

1.2.3 数据处理 测序结果通过DNAMAN软件对其数据进行拼接，运用Oligo 7 Primer Analysis Software将试验绵羊序列与绵羊线粒体基因组标准序列(GenBank：AF010406)比对分析。使用EXCEL软件整理母羊的产羔记录，开展线粒体-(T7719G)基因型频率及其与胎产羔数的关联性分析。采用SPSS 23.0统计分析软件进行分析比较。

1.3 建立线性回归模型

线性模型：=++++，其中为产羔数，为群体均值，为第i个胎次的固定效应(i=1，2，3，4，5，6，7)，为第n种-(T7719G) 基因型的固定效应(j=1,2)，为第m种产羔季节的固定效应(m=1，2，3，4)，为随机残差效应。将产羔季节转换为虚拟变量(虚拟变量1，2，3的值分别为0、0、0时为春季；1、0、0时为夏季；0、1、0时为秋季；0、0、1时为冬季)。

2 结 果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

线粒体-(T7719G)基因片段大小为290 bp，电泳结果如图1所示，PCR产物条带清晰，可用于测序。

M.DNA相对分子质量标准；1～5.样品1～5的PCR扩增产物M. DNA marker; 1-5. PCR products of sample 1-5图1 tRNA-Lys(T7719G)基因PCR扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products of tRNA-Lys (T7719G) gene

2.2 PCR扩增产物的测序结果

PCR扩增产物的测序结果如图2、3所示，线粒体-基因编码区7719位点存在T→G变异。

2.3 线粒体tRNA-Lys(T7719G)产羔性能及群体遗传学分析

-(T7719G)基因多态性结果如表1所示，杂交羊群出现G和T两种等位基因，基因频率分别为57.80%和42.20%，携带G等位基因的母羊平均胎产羔数较携带T等位基因的母羊多0.08只。

图2 tRNA-Lys基因T7719G变异位点测序结果Fig.2 Sequencing results of T7719G variation site of tRNA-Lys gene

杂交母羊胎产羔数分布情况如表2所示，胎产单羔的比例为52.27%，胎产双羔的比例为36.30%，胎产多羔的比例为11.43%。

2.4 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及产羔季节与胎产羔数的相关性分析

结果(表3)表明，胎产羔数与虚拟变量3、胎次、携带G基因数均有显著相关性且具有统计学意义(Significance<0.05)，均呈正相关(Pearson系数>0)，胎产羔数与虚拟变量1和虚拟变量2虽然并没有显著相关性，但由于虚拟变量1、2、3均由季节变量转化而来，因此将其纳入多元线性回归方程进行分析。相关分析结果表明在季节不变的情况下，胎产羔数随胎次及G基因携带母羊数量的增加而增加。

2.5 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及产羔季节与胎产羔数多元线性回归模型分析

方差分析结果(表4)表明，检验统计量F为3.698，Significance值为0.003，由此可认为线粒体-(T7719G)基因突变、胎次及产羔季节与胎产羔数存在显著差异，模型整体显著，具有统计学意义。由回归系数表(表5)可知，胎产羔数与胎次、虚拟变量3、携带G基因数之间有显著线性关系(Significance < 0.05)，通过容差和VIF值判断模型不存在严重的多重共线性(VIF < 20)。胎产羔数预测模型方程为：胎产羔数=1.201+(-0.009)×虚拟变量1+0.043×虚拟变量2+0.194×虚拟变量3+0.061×胎次+0.123×携带G等位基因母羊数量，回归方程表明每个-基因突变为G等位基因可使群体胎产羔数增加0.123只。

图3 tRNA-Lys基因T7719G变异位点测序峰图Fig.3 Sequencing peak of T7719G variation site of tRNA-Lys gene

表1 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因型频率分布及平均胎产羔数

表2 母羊胎产羔数分布情况

3 讨 论

本研究结果表明，-(T7719G)基因在小尾寒羊母羊杂交群体中存在两种等位基因分别为G和T，等位基因频率为57.80%和42.20%，说明在小尾寒羊母羊群体中G等位基因变异较为普遍，携带G等位基因个体平均产羔数比携带T等位基因的个体多0.08只。季节、胎次是影响绵羊胎产羔数的重要因素，因此，本研究将上述两个因素与-(T7719G)基因变异进行了相关分析，结果表明，产羔季节、胎次、基因型对母羊胎产羔数都具有显著的影响。这就提示在生产实践中，尽量在短日照季节集中配种，在羊群管理中尽量提高经产母羊的比例。Wang等发现了13个线粒体tRNA变异，变异个体的繁殖性能显著比野生型个体产活仔数多0.989只，这一结果与本研究结果类似，同时表明线粒体tRNA基因与繁殖性能的相关性，这一结果与Wang等的报道一致。多元线性回归分析表明，G等位基因可使胎产羔数增加0.123只。因此，可以通过提高携带G等位基因的母羊个体数量来提高后代产羔数。提高产羔率是提高繁殖效率的重要方式，常见育种方式对于低遗传力的产羔性状选种效果非常有限，使用分子标记辅助选种可缩短世代间隔提高选育效率。

表3 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及产羔季节与胎产羔数的相关分析

表4 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及产羔季节与胎产羔数的方差分析模型

表5 线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因、胎次及产羔季节与胎产羔数多元线性回归系数

线粒体在保证排卵和胚胎发育方面具有重要作用。早期胚胎中主要由线粒体通过糖酵解为受精卵提供能量，之后则转变为氧化磷酸化。线粒体在卵母细胞发育成熟过程中的分布变化和线粒体基因组拷贝数的变化以及产生ATP能力的大小都会影响卵母细胞的发育情况。线粒体基因组通过非孟德尔遗传形式影响线粒体功能，作为动物细胞器内的唯一遗传物质，只编码与氧化呼吸链相关的蛋白质和转运体，具有分子结构简单、无组织特异性、母系遗传、拷贝数高、进化速率快等特点。因其独特的性质，线粒体基因组成为研究进化的重要分子生物学工具。在生殖过程中，线粒体基因组遵循母系遗传方式，只通过卵细胞将其中的遗传信息传给下一代，使得子代中线粒体基因组序列和母亲的一致。牟天伊等研究发现，线粒体基因组拷贝数与卵母细胞质量、胚胎发育情况有关，结果表明线粒体基因组变异会引起线粒体结构、功能的改变，同时也与卵母细胞受精有关。研究报道，线粒体变异会与生理状态有关，会影响蛋白质合成的效率，进而影响表型性状。线粒体-(T7719G)基因变异通过生殖细胞影响产羔数的生理机制有待从细胞水平上深入研究。

4 结 论

-(T7719G)基因在以小尾寒羊为母本的杂交羊群中存在G、T两种等位基因，等位基因频率分别为57.80%和42.20%，携带G等位基因的母羊平均胎产羔数较携带T等位基因的母羊多0.08只。在季节因素不变的情况下，产羔数随胎次以及携带G等位基因母羊个体数量的增加而增加。建立了胎产羔数预测模型方程：胎产羔数=1.201+(-0.009)×虚拟变量1+0.043×虚拟变量2+0.194×虚拟变量3+0.061×胎次+0.123×携带G基因母羊数量，羊群中增加一个携带G等位基因的个体，胎产羔数增加0.123只。本研究进一步证实-(T7719G)可作为分子标记进行辅助选种，提高以小尾寒羊为母本的羊群产羔数。