以减毒沙门菌为载体的SS和CST双表达DNA疫苗经不同途径免疫犊牛的效果评价

袁 婧，张欣欣，周 迪，杨 帅，周家彦，梁爱心,2，杨利国,2*

(1. 华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；2. 水牛繁育与加工湖北省工程研究中心，武汉 430070)

生长抑素(somatostatin，SS)能够抑制细胞的增殖和多种神经内分泌激素的分泌，包括生长激素(GH)、胰岛素(INS)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T)和四碘甲状腺原氨酸(T)等，从而抑制动物的生长。皮质抑素(cortistatin，CST)是一种内源性神经肽，能与所有的SS受体结合，具有SS类似的功能。利用SS的免疫中和作用可以促进畜禽的生长。目前，国内外已经研制了多种生长抑素DNA疫苗，在小动物上取得了良好的免疫效果和增重效果，但在大动物上的效果却不容乐观。为了进一步提高生长抑素DNA疫苗的免疫效果，本实验室构建了以减毒沙门菌为载体的SS和CST双表达DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)，发现其能显著提高小鼠的平均日增重，并探索了鼻饲接种双表达DNA疫苗对水牛免疫效果的影响，发现增重效果不明显，这严重限制了双表达疫苗的推广应用。因此，急需探讨双表达DNA疫苗在大动物上的最佳免疫程序。

影响DNA疫苗免疫效果的因素有很多，其中,免疫接种途径是影响DNA疫苗效力的一个重要方面。不同的免疫途径会影响抗原DNA的转染效率 (吸收、表达) 和递呈效率，从而影响DNA疫苗的免疫效力和免疫应答的持久性。DNA疫苗的接种方式主要包括肌肉注射、基因枪、口服、鼻饲、滴眼等多种途径。近年来，多种途径联合免疫已经成为提高DNA疫苗免疫原性的新型接种方式，且多种途径联合免疫的效果要优于单一途径免疫。

SS和CST双表达DNA疫苗研究的最终目的是应用于生产实践，目前，该疫苗免疫多采用单一的免疫方式，而采用组合免疫方式来提高反刍动物生长性能的研究尚未见报道。本试验探讨了口服、喷鼻、口服+喷鼻3种不同免疫方式接种SS和CST双表达DNA疫苗对奶水牛犊牛免疫效果以及促生长效果的影响，为优化DNA疫苗的免疫程序、促进其推广应用奠定基础和提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DNA疫苗 以减毒沙门菌(C500)为载体的SS和CST双表达非抗性筛选DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)由祖卓鑫构建(质粒图谱如图1所示)，质粒、菌种由本实验室提供。

GMCSF. 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，467 bp；S/SS. 乙肝表面抗原/生长抑素，388 bp；S/CST. 乙肝表面抗原/皮质抑素，726 bp；2A. 2A肽，猪teschovirus-1病毒，66 bpGMCSF. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，467 bp; S/SS. Hepatitis B surface antigen/Somatostatin, 388 bp; S/CST. Hepatitis B surface antigen/Cortistatin，726 bp; 2A. P2A, porcine teschovirus-1 virus, 66 bp图1 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd质粒图谱Fig.1 Plasmid map of pVGS/2SS-2A-S/CST-asd

1.1.2 试验动物 从湖北劲牛牧业有限公司选择27头2～6月龄、体重体况相近、健康无疾病的杂交奶水牛犊牛用于试验。

1.1.3 主要试剂 无内毒素质粒小提试剂盒、全血液DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；牛GH、IGF-1、IL-4、INF-γ、T、TELISA试剂盒均购自(泉州)睿信生物科技有限公司；2×Master Mix、ELISA显色液、ELISA终止液购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；羊抗牛IgG/HRP购自SouthernBiotech公司；DNA Maker、限制性内切酶均购自Thermo Fisher Scientific公司；生长抑素标准抗原、皮质抑素标准抗原均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 质粒的鉴定与DNA疫苗的大量制备

将以减毒沙门菌(C500)为载体的重组DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)从-80 ℃超低温冰箱取出，用接种环接种于LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑取单克隆菌落于200 mL的LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，按照北京天根高纯度质粒小提试剂盒的说明书，提取质粒。将双表达质粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd分别经Ⅰ/d Ⅲ和Ⅰ/d Ⅲ进行双酶切，37 ℃水浴2～3 h， 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将鉴定正确的质粒送至武汉擎科生物技术有限公司测序。

将鉴定正确的重组菌按1∶100的体积比接种于LB液体培养基，37 ℃、220 r·min振摇培养16～18 h， 采用平板计数法检测细菌浓度，用灭菌的PBS调整细菌浓度至3×10CFU·mL，4 ℃保存备用。

1.3 动物分组、免疫、饲养管理及样品采集

将27头2～6月龄的奶水牛犊牛随机分为4组， 试验组每组均为7头，对照组为6头，试验组设计3种不同的免疫方式(口服、喷鼻、口服+喷鼻)，分别记为O组、N组、ON组。3个试验组疫苗的浓度均为3×10CFU·mL，剂量为15 mL·头，每天两次(早上9:00，下午15:00)，连续免疫3 d。对照组(C组)每天用等体积的PBS口服和喷鼻免疫。首次免疫后间隔2周，以相同程序加强免疫一次。试验期间，所有犊牛均进行人工哺乳(2 L·头，每天喂两次)，试验动物自由饮水、采食(青贮+稻草)。

分别于初免后2、6、10周颈静脉采血，每头牛在采血前称重、测体尺(体高、体长、体斜长、胸围、胸深、腿臀围)，采集的血液，3 000 r·min离心10 min，取上清用于后续试验。

1.4 SS和CST抗体检测

采用间接ELISA方法检测不同时期所有试验牛血清中抗生长抑素和皮质抑素抗体。测定参照刘青方法。在同一稀释倍数下，样本血清的OD值>阴性血清OD平均值+2倍标准差()时，则此稀释倍数即为样本血清的最终抗体滴度，判定为阳性，反之为阴性。

1.5 相关激素及细胞因子的检测

参照董方晓的方法，用双抗体一步夹心ELISA法检测犊牛血清中GH、IGF-1、T、T、IL-4、 INF-γ的含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样品中GH、IGF-1、T、T、IL-4、INF-γ的浓度(计算值乘以5为最终浓度值)。

1.6 血清生化指标检测

将血清样品送至生工生物工程武汉分公司，采用全自动生化分析仪BS-420进行血清生化指标检测，检测项目有总蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游离脂肪酸(NEFA)、尿素氮(BUN)。

1.7 数据分析

2 结 果

2.1 重组质粒的酶切鉴定

双表达质粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd的双酶切结果如图1，质粒经Ⅰ和d Ⅲ酶切后，DNA产物电泳后分别在5 000 bp附近以及1 500 bp附近出现条带(1和2)，与p-2A-S/CST-asd片段(4 535 bp)和GM/2SS片段(1 245 bp)大小一致；经Ⅰ和d Ⅲ酶切后，DNA产物电泳后分别在5 000 bp附近以及750 bp附近出现条带(3和4)，与pVGS/2SS-asd片段(4 992 bp)和2A-S/CST片段(798 bp)大小一致。重组质粒的测序结果与构建图谱序列进行BLAST对比，匹配率100%，无基因突变，进一步说明实验室所保存的工程菌具有良好的稳定性，满足后续试验需求。

2.2 不同免疫方式对犊牛血清SS和CST抗体及细胞因子的影响

3种免疫方式均可以诱导犊牛产生SS抗体(表1)和CST抗体(表2)，各个试验阶段抗体水平不显著(>0.05)。6周时，O组、N组的抗体水平以及阳性率下降，虽然ON组的阳性率下降，但抗体水平升高。在10周时，O组和N组均检测不到SS抗体和CST抗体，ON组能检测到SS抗体，阳性率只有14.29%。从阳性率和产生抗体的持久性方面综合评判，喷鼻+口服的免疫方式优于喷鼻免疫方式，喷鼻免疫方式优于口服免疫方式。

从表3可知，随周龄的增加，3个试验组IL-4的含量均呈下降趋势，这与检测的抗体阳性率结果一致；2周时，3 个试验组INF-γ、IL-4的含量均高于对

1、2. 双表达质粒经Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的产物；M. DNA相对分子质量标准；3、4. 双表达质粒经Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的产物1, 2. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ; M. DNA marker; 3, 4. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Xho Ⅰ and Hind Ⅲ图2 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd质粒双酶切产物电泳图Fig.2 Electrophoresis diagram of double digestion products for pVGS/2SS-2A-S/CST-asd plasmid

照组，但各组之间差异不显著(>0.05)；6周时，ON组INF-γ的含量显著高于C组(<0.05)；10周时，ON组INF-γ的含量均显著高于O组、N组、C组(<0.05)。说明3种免疫方式均能较好地激发机体产生体液免疫和细胞免疫。

2.3 不同免疫方式对犊牛生长性能的影响

从表4可知，在各时期内，均以ON组的平均日增重最高，其次为N组、O组、C组，与抗体阳性率结果一致；在初免后2周，ON组日增重显著高于其他各组(<0.05)，而其他各时期内各组间日增重差异均不显著(>0.05)；在整个试验周期(0～10周)， 与C组相比，O组、N组、ON组犊牛日增重分别提高了5.26%、10.53%、15.79%。由表5可知，6、10周时，ON组的胸围显著高于C组(<0.05)；10周时，ON组的腿臀围显著高于C组、N组(<0.05)，其他体尺指标均为无显著差异(>0.05)。

2.4 不同免疫方式对犊牛血清中生长相关激素的影响

从表6可知，不同阶段，各试验组的GH、IGF-1、T的浓度均高于对照组，且ON>N>O组，与增重趋势一致；其中，2周时，3个试验组血清中的IGF-1的浓度显著高于C组(<0.05)；6周时，ON组T和T的浓度均显著高于O组、C组(<0.05)，各组之间GH、IGF-1的浓度差异不显著(>0.05)；10周时，ON组T的浓度显著高于对照组(<0.05)，各组之间GH、IGF-1、T的浓度差异不显著(>0.05)。

表1 不同免疫方式各组犊牛血清中SS抗体水平

表2 不同免疫方式各组犊牛血清中CST抗体水平

表3 不同免疫方式各组犊牛血清中细胞因子水平

表4 不同免疫方式各组犊牛的日增重

表5 不同免疫方式组间犊牛的体尺

表6 不同免疫方式组间犊牛血清中生长相关激素水平

2.5 不同免疫方式对犊牛血清生化指标的影响

在初免后2及6周，3个免疫组血清的总蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游离脂肪酸(NEFA)的含量略高于对照组，尿素氮(BUN)的含量低于对照组(表7)， 但各项指标在各组之间差异均不显著(>0.05)。

表7 不同免疫方式组间犊牛血清生化指标

3 讨 论

黏膜是机体最大的免疫器官，分布在呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及某些外分泌腺(唾液腺、胰腺、泪管等)。通过黏膜表面(如口腔、鼻、直肠或阴道等)接种疫苗不仅可以激发保护性黏膜免疫反应，还可诱导全身抗原特异性体液免疫和细胞免疫。以减毒沙门菌为载体的DNA疫苗可以通过口腔或鼻腔进行免疫接种，有效地在动物体内表达外源抗原。本研究采用口服、喷鼻、口服+喷鼻3种免疫方式免疫2～6月龄的奶水牛犊牛，均能诱导犊牛产生SS和CST抗体，且加强免疫后ON组的SS和CST抗体水平有所提高，在初免后10周，只有ON组检测到了阳性，说明口服+喷鼻的免疫方式可以诱导犊牛产生更持久的免疫应答。O组、N组均检测不到抗体，提示在6～10周，疫苗的免疫效果已逐渐消失，具体的消失时间还需要进一步探究。整个试验期间，从产生抗体的持久性和阳性率综合来看，口服+喷鼻的免疫方式要优于喷鼻免疫，喷鼻免疫优于口服免疫。这可能是由于口服免疫产生的免疫应答持续时间较短。一方面，鼻腔提供了一个广泛的、高度血管化的和相对容易渗透的表面，提高了鼻黏膜摄取DNA疫苗的效率，而且鼻腔黏膜不仅可以激发上呼吸道可产生较强的免疫应答，还可以诱导机体下呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道产生明显的免疫应答；另一方面，口腔免疫也可以通过口腔黏膜、消化道黏膜以及胃肠道黏膜递呈抗原，诱导动物机体产生有效的免疫应答。因此多种方式联合免疫要优于单一的免疫方式。

与其他促生长的DNA疫苗相比，祖卓鑫首次采用2A肽双顺反子原件，引入平衡致死系统构建了非抗性筛选SS和CST双表达DNA疫苗，有效提高了下游基因的表达量及其免疫效力。该双表达DNA疫苗可以诱导机体产生SS抗体和CST抗体，中和内源性生长抑素，从而提高生长激素的分泌，并最终提高生长速率。SS基因疫苗可以改善小鼠、羊、肉牛、仔猪、鸡等动物的生产性能。在本研究中，不同阶段犊牛的平均日增重由高到低的顺序为口服+喷鼻组>喷鼻组>口服组>对照组，进一步证明了多种途径联合免疫的效果要优于单一途径免疫；但各组平均日增重水平整体较低，这可能与牛场的饲养管理条件有关。另外，体尺指标也可以反映犊牛的生长发育状况，与犊牛的生产性能、繁殖性能有着密切联系。本研究首次探究了该疫苗对犊牛体尺的影响，结果发现，生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗通过口服+喷鼻的免疫方式对水牛犊牛腿臀围和胸围的影响最显著。

畜禽的生长发育受多种内源性激素共同调节，主要包括GH、IGF-1、T、T等。GH能促进机体组织的生长，下丘脑分泌的GH可直接作用于动物靶器官，分泌IGF-1；IGF-1可以促进机体细胞增殖，调节蛋白质合成，促进动物组织器官发育和骨骼生长。甲状腺激素(包括T和T)是影响动物生长发育和新陈代谢的主要激素，对幼龄动物正常生长和骨骼发育的影响尤为突出，且T和T是GH发挥促生长作用的基础。大量研究表明，生长抑素DNA疫苗可以提高机体内GH、IGF-1、T、T的浓度，从而促进动物的生长。在本试验中，不同免疫时期犊牛体内GH、IGF-1、T、T的水平：口服+喷鼻组>喷鼻组>口服组>对照组，与增重趋势一致，进一步说明了生长抑素和皮质抑素DNA疫苗可以通过提高机体内与生长相关的激素的水平，从而达到促生长效果，表明该疫苗通过口服+喷鼻联合免疫的方式产生的促生长效果更佳。

DNA疫苗的作用机理就是其通过不同的途径进入机体内，在动物体内产生微量的抗原蛋白，从而引发全面的体液免疫和细胞免疫应答反应。Th1细胞主要参与细胞免疫应答，而Th2细胞在体液免疫应答中起核心作用，因此，Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2等)和Th2细胞因子(IL-4、IL-10等)的检测可以在一定程度上反映细胞和体液免疫反应。与韩丽的研究结果一致，本研究结果表明，不同免疫方式组犊牛血清中IFN-γ和IL-4的含量均高于对照组，说明3种免疫方式接种此DNA疫苗都能有效地激发机体产生体液免疫和细胞免疫应答。其中，口服+喷鼻组INF-γ的含量显著提高，说明口服+喷鼻这种免疫方式接种此双表达DNA疫苗，可以显著提高机体的细胞免疫反应；因此，双表达DNA疫苗的口服+喷鼻的免疫效果要优于口服或喷鼻免疫效果。关于生长抑素DNA疫苗对动物血清生化指标的影响，研究结果也不尽相同。本研究发现无论以哪种方式免疫接种双表达DNA疫苗，对犊牛血清总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸以及尿素氮的含量均无明显影响。可能是由于受试动物、免疫途径、免疫剂量不同以及饲养管理等多种因素造成的，而且免疫并非直接影响代谢，是通过影响GH、IGF-1等内分泌激素的分泌，从而影响机体的代谢，具体机制有待于进一步研究证实。

4 结 论

3种不同免疫方式均可以使奶水牛犊牛产生较好的免疫效果，但是口服+喷鼻免疫产生的抗体水平持续时间更长，阳性率更高，且增重效果更好。结果表明，在给犊牛接种促生长DNA疫苗时，口服+喷鼻联合免疫效果要优于喷鼻免疫，喷鼻免疫优于口服免疫。