藜蒿总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

肖恺灵 张媛媛 齐致源 付家敏 王琤韡

（江西科技师范大学生命科学学院，江西 南昌 330013）

藜蒿(Artemisia selengensis Turcz.)属桔梗目菊科，别名芦蒿、柳叶蒿、蒌蒿、水艾、水蒿等，为多年生草本植物，植株具清香气味[1]。藜蒿作为一种特色植物资源，遍生于江西省鄱阳湖附近区域[2]。民间多食其嫩茎叶，全株亦可入药，安全无副作用，其药用价值在古本草书中已有记载，明代李时珍的《本草纲目》中写道：“藜蒿味平甘，主五脏邪气，风寒湿痹，补中益气，长毛发令黑，疗心悬，少食长饥；久服轻身耳目聪明不老”[3]。研究表明，藜蒿富含黄酮类、多酚类等活性成分，能够清除多种自由基，具有良好的抗氧化活性[3-5]。因此藜蒿具有清火消炎以及治疗寒冷腹痛、急性肝炎等功效，也被发现可用于治疗黄胆型或无黄胆型肝炎[7]。

总黄酮（Flavonoids）是一类黄酮类化合物，属植物次生代谢产物，具有抗肿瘤、降血压、抗氧化及促进新陈代谢等功能[7]。现代研究表明，总黄酮因酚羟基上的氢原子与过氧自由基结合生成黄酮自由基，进而与其他自由基反应，从而终止自由基链式反应[8]，因此总黄酮能够提高机体抗氧化及清除自由基的能力，且无毒无害，可作为绿色抗氧化剂。

目前，关于藜蒿总黄酮的抗氧化等研究较少，对于藜蒿这种特色植物的开发也处于起步阶段。相比于新兴的微波辅助萃取法和超临界流体萃取法，溶剂回流萃取法作为传统的醇提法虽然耗费时间长、步骤较多，但采用的乙醇溶剂具有低毒性、价格低廉、使用简单等优点，在工业方面提取藜蒿总黄酮时具有更大的优势。因此本实验采用溶剂回流萃取法，优化藜蒿提取工艺条件，为大规模提取藜蒿总黄酮提供参考依据。在单因素试验基础上结合正交试验优化提取工艺，提高总黄酮得率，以DPPH 自由基清除率、OH自由基清除率和还原能力为指标，对藜蒿总黄酮的体外抗氧化能力进行评价。研究为藜蒿资源有效开发提供了合理的数据，为藜蒿总黄酮提取的工业化生产提供了具体的工艺参数。

1 材料与方法

整株野生藜蒿（采摘自江西省鄱阳湖附近）。芦丁标准品（合肥博美生物科技有限责任公司）；无水乙醇（北京化学试剂有限公司）；亚硝酸钠、硝酸铝、AlCl3·6H2O、HCl、NaOH（西陇科学股份有限公司）；DPPH（上海化成工业发展有限公司）。以上试剂均为分析纯。

ES2000 型电子天平（天津市德安特传感技术有限公司）；DHG-9015A 型电热鼓风恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DK-S26 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；722N 可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；RE-522AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KL05A 型高速台式冷冻离心机（凯特实验仪器有限公司）。

1.3.1 黄酮标准液的制备

准确称取芦丁0.010 g，置于50 mL 容量瓶中，以60%乙醇溶解定容至刻度，取25 mL 定容后的溶液用蒸馏水稀释至50 mL，配制成浓度为0.1 mg/mL 的芦丁对照品溶液。准确量取芦丁标准液2、4、6、8、10 mL 分别加入5 支试管中，向每支试管中加入5 mL 30%乙醇溶液、0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀放置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，最后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，蒸馏水稀释至25 mL，放置25 min。在可见分光光度计上设定波长510 nm，测定各试管中溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，溶液浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线图。

1.3.2 藜蒿总黄酮提取工艺

取整株藜蒿在鼓风干燥箱内60 ℃下烘干至恒重，超微粉碎后过80 目筛得到样品粉末。准确称取经处理后的藜蒿样品粉末1.000 g 置于25 mL圆底烧瓶中，加入一定体积的70%乙醇溶液浸泡1 h 后，放入一定温度恒温水浴锅中回流提取一定时间，得到的提取液用滤纸过滤定容至25 mL。在见分光光度计上设定波长510 nm，测定试管中溶液的吸光度。

1.3.3 藜蒿总黄酮得率的计算

利用线性回归方程计算藜蒿中总黄酮得率：

式中：C 为样品中黄酮的浓度（g/L）；V 为样品提取液的体积（mL）；n 为样品提取液的稀释倍数；m 为藜蒿样品干粉的质量（g）。总黄酮得率r 的单位为mg/g。

1.3.4 藜蒿总黄酮提取工艺优化

1.3.4.1 单因素试验设计

在藜蒿粉末质量（1.000 g）不变的情况下，设置提取温度、提取时间、液固比三个变量，研究其对藜蒿总黄酮提取率的影响。设液固比15 mL/g、提取时间1.5 h 为不变量，研究分析5 个不同提取温度（50、60、70、80、90 ℃）对藜蒿总黄酮提取率的影响；设液固比20 mL/g、提取温度70 ℃为不变量，研究分析5 个不同提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）对藜蒿总黄酮提取率的影响；设提取温度70 ℃、提取时间1.5 h 为不变量，研究分析5 个不同液固比（10、15、20、25、30 mL/g）对藜蒿总黄酮提取率的影响。

1.3.4.2 正交试验设计

通过单因素试验，确定影响藜蒿总黄酮得率的主要因素和各因素参数范围，选择对得率影响较大的提取温度、液固比和提取时间3 个因素设计正交试验L9（33）。正交试验因素水平见表1。通过正交试验确定藜蒿总黄酮提取的最佳工艺组合。

表1 藜蒿总黄酮醇提法正交试验因素水平

1.3.5 体外抗氧化活性试验

1.3.5.1 总还原能力的测定

取上述优化条件下的提取物，减压浓缩成稠膏，使用70%的乙醇溶解并稀释，得浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L 的黄酮溶液，使用相应浓度的VC 做对照试验。参照李冬梅等[10]的方法，并做相应修改。取1%的铁氰化钾2.5 mL 与0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲溶液0.2 mL，加入待测样品溶液，50 ℃恒温放置30 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，离心取上清液1 mL，加入1 mL 的0.1% Fe Cl3、4 mL 蒸馏水混匀，静置10 min，于700 nm 处测吸光度。

还原能力计算公式为 还原能力=A1-A2（2）其中，A1为样品组吸光度；A2为样品本底吸光度（以等体积蒸馏水代替FeCl3溶液）。1.3.5.2 清除OH 自由基能力的测定

参照田建华等[11]的方法，并做相应修改。取2 mmol/L FeSO4溶液5 mL，6 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液15 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液5 mL，摇匀混合。在37 ℃恒温水浴15 min，以蒸馏水为参照，于517 nm 处测定吸光度，计算清除率：

OH 自由基清除率=(A0-A1)/A0×100% （3）式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品溶液的吸光度。

1.3.5.3 清除DPPH 自由基能力的测定

参照董玉玮等[12]的方法，并做相应调整。取不同浓度提取液3 mL，精确取0.4 mL/mg 的DPPH-乙醇溶液3 mL，试管暗置30 min，4000 r/min 离心10 min，使用无水乙醇做对照品试验。取上清液于517 nm 处测吸光度，并计算清除率：

DPPH 自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

（4）其中，A0为3 mL 无水乙醇+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A1为3 mL 样品溶液+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A2为3 mL 样品溶液+3 mL 无水乙醇的吸光度。

2 结果与分析

根据试验设计方法，在波长510 nm 处测定溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），溶液浓度（X）为横坐标，绘制出标准曲线图1。求出回归方程：y=2.177x+0.0042，相关系数R2=0.999，说明芦丁浓度与吸光度呈线性关系。

图1 芦丁标准曲线

2.2.1 液固比对藜蒿总黄酮得率的影响

设置提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、乙醇体积分数60%，以液固比为变量考察其对总黄酮得率的影响，结果如图2 所示。由图2 可得出，随着液固比增大，总黄酮得率在10、15、20 mL/g 范围内增高，在液固比为20 mL/g 时达到最大值，当液固比超过20 mL/g 时，总黄酮得率下降。原因可能是液固比较低时乙醇溶剂不足导致藜蒿黄酮提取不完全，而液固比较高时，乙醇溶剂过多影响藜蒿黄酮提取率。因此，20 mL/g 的液固比是藜蒿黄酮提取的最佳参数。

图2 液固比对藜蒿总黄酮得率的影响

2.2.2 提取温度对藜蒿总黄酮得率的影响

设置提取时间1.5 h、液固比15 mL/g、乙醇体积分数60%，在提取温度50、60、70、80、90 ℃范围内考察其对藜蒿总黄酮得率的影响，结果如图3 所示。由图3 可知，总黄酮得率随提取温度的变化而变化，在提取温度为80 ℃时达到得率的最大值，此时提取温度再升高，黄酮得率反而下降。原因可能是提取温度升高，分子运动更加剧烈，增大了黄酮提取率，但提取温度过高，破坏了分子结构导致藜蒿总黄酮提取率下降。所以，80 ℃的提取温度是藜蒿黄酮提取的最佳条件。

图3 提取温度对藜蒿总黄酮得率的影响

2.2.3 提取时间对藜蒿总黄酮得率的影响

设置提取温度70 ℃、液固比15 mL/g、乙醇体积分数60%，在0.5-2.5 h 范围内考察提取时间对藜蒿黄酮提取率的影响，结果如图4 所示。由图4 可知，在一定范围内藜蒿总黄酮得率随提取时间而变化，并在提取时间为1.5 时达到最大值。原因可能是提取时间过短，藜蒿黄酮溶出过少导致总黄酮得率低，而提取时间过长，藜蒿中的总黄酮会发生热分解损失，藜蒿黄酮提取率下降。因此，1.5 h 的提取时间是藜蒿黄酮提取的最佳条件。

图4 提取时间对藜蒿总黄酮得率的影响

各因素对藜蒿总黄酮得率的影响并非单一线性，实际上总黄酮得率受到提取温度、提取时间、液固比、乙醇体积分数因素的交叉影响，而乙醇体积分数因素对藜蒿总黄酮得率影响较小，因此根据单因素考察试验结果，选取提取温度、提取时间、液固比三个因素设置正交试验的因素水平，对藜蒿总黄酮的提取工艺进行进一步的优化。正交试验结果和方差分析如表2、表3 所示。由表3 可知，各因素对提取藜蒿总黄酮的影响不同，在本研究中提取温度影响最大，其次是液固比，最后是提取时间。藜蒿总黄酮的最佳提取参数组合为A3B2C2，即最佳提取工艺条件是提取温度80 ℃、液固比20 mL/g、提取时间1.5 h。

表2 藜蒿总黄酮醇提法正交试验结果

用正交设计助手软件对试验结果进行方差分析，P＜0.05 认为有显著性差异，P＜0.01 则认为有极显著性差异。由表3 可知，因素A 在P＜0.01水平上有极显著性差异，因素B 和因素C 在P＜0.05 水平上有显著性差异。如表4，为验证试验结果，考察预测结果的可靠性，在优化的工艺参数下（提取温度80 ℃、液固比20 mL/g、提取时间1.5 h、乙醇体积分数60%），进行三次平行验证试验，所得藜蒿总黄酮平均得率为38.32 mg/g。

表3 藜蒿总黄酮醇提法正交实验方差分析

表4 验证实验结果

2.4.1 藜蒿总黄酮总还原能力

测定藜蒿总黄酮和VC 的总还原能力结果见图5。随着黄酮浓度和VC 浓度的增加，还原能力都出现较为明显的上升，当VC 的浓度达到0.8 g/L 时，吸光度值达到最大，为1.040；而总黄酮的浓度为0.8 g/L 时，吸光度为0.971。藜蒿总黄酮总还原能力随着总黄酮浓度的增加而提高，与同浓度VC 的还原能力相近。由此证明了藜蒿总黄酮具有一定的还原能力。

图5 不同浓度的藜蒿总黄酮总还原能力

2.4.2 藜蒿总黄酮对OH 自由基清除能力

由图6 可知，在总黄酮浓度为0.1-0.8 g/L 范围内时，藜蒿黄酮对OH 自由基有一定的清除作用，清除能力随着黄酮浓度的增加而增强，且略高于VC 的清除能力，当浓度达到0.8 g/L 时，黄酮对OH 自由基的清除率为91.12%，VC 对OH 自由基的清除率为90.68%，二者清除能力较为接近。结果表明藜蒿总黄酮具有良好的清除OH 自由基的能力。

图6 藜蒿总黄酮对OH 自由基的清除率

2.4.3 藜蒿总黄酮对DPPH 自由基清除能力

图7 为藜蒿黄酮和VC 清除DPPH 自由基能力曲线。由图7 可知，藜蒿黄酮在浓度0.1-0.8 g/L 范围内，对DPPH 自由基的清除能力随着浓度的增加有所提高，在0.1-0.3 g/L 浓度范围内，曲线较平缓，在0.3-0.7 g/L 浓度范围内，清除能力增加较快，在浓度达到0.8 g/L 时，黄酮对DPPH自由基的的清除率为77.32%，VC 对DPPH 自由基的的清除率为86.44%，黄酮的清除能力略低于VC。说明藜蒿总黄酮有一定的清除DPPH 自由基的能力。

图7 藜蒿总黄酮对DPPH 自由基的清除率

3 讨论与结论

实验中通过单因素的考察与正交试验分析，发现提取温度对藜蒿总黄酮的提取影响较大。乙醇的沸点为78.31 ℃，因此采用乙醇为溶剂的萃取法的适宜温度应在乙醇的沸点左右。本实验得出最佳提取温度为80 ℃，这与其他植物总黄酮提取温度相近[9-11]。杨凌君等[12]同样采用醇提法研究了藜蒿叶中总黄酮的提取工艺优化，得到的最佳工艺参数为液固比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h，与本研究的结果相接近。此外，抗氧化活性结果显示：藜蒿整株提取的总黄酮对DPPH、OH 自由基具有良好的清除能力，并且具有一定的总还原能力，谢星等[13]和Zhang 等[14]的研究结果也证明了这一点。

藜蒿为药食两用新资源，富含多种对人体健康有利的营养活性成分，有望用作天然绿色的抗氧化剂。因此，有必要进一步研究其抗氧化的作用机制以及提取工艺，为藜蒿的开发利用提供依据。