固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮的含量

杨开智 梁 丹 黄生林

（常德市畜牧水产事务中心，湖南 常德 415000）

甲基睾酮（MET）是一种人工合成的代谢类固醇，属于蛋白同化激素，具有增强雄性体性和蛋白同化双重作用，应用于水产养殖可以提高产量和控制性别[1-2]。然而其在人体的极少残留也会造成人内分泌紊乱、性早熟、胎体中毒、致畸致癌等严重后果[3]。因此，甲基睾酮在水产品中的残留引起了人们的重视，世界上大多数国家禁止在水产品养殖和治疗中使用甲基睾酮。2001 年我国农业部实施的行业标准NY 5070—2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》中，将甲基睾酮列为禁用药物。2003 年农业部发布的235 号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中也规定甲基睾酮为禁用兽药。

目前甲基睾酮的检测方法是高效液相色谱法[4-5]和液相色谱-串联质谱法[6-7]。液相色谱串联质谱法提高了对目标物的准确性和灵敏度，但是由于仪器昂贵，检测成本高，不易推广。高效液相色谱法在使用上方便、快捷，灵敏度能达到要求，因此本文对前处理过程和色谱条件进行优化，利用紫外检测器对甲基睾酮进行了检测。实验结果表明，改进后的方法缩短了前处理时间，灵敏度高，能实现对甲基睾酮的快速检测，在提高实验样品回收率的同时，也提高了工作效率。这对加强MET 的检测、保障人们的饮食安全和身体健康具有重要意义。

1 实验

Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，配备2489 紫外可见光检测器；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；24 孔氮吹仪（美国Organmation 公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

甲基睾酮标准品（德国Dr. Ehrenstorfer 公司，纯度≥98%）；乙酸乙酯、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；正己烷（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；固相萃取小柱（美国Waters 公司）；实验室用水均为屈臣氏蒸馏水。

标准储备液：精确称取适量的甲基睾酮，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成浓度为100 μg/mL 的标准储备液。-18 ℃避光保存，有效期6 个月。

标准中间液：分别准确吸取0.5 mL 标准储备液至50 mL 容量瓶中，甲醇定容，甲基睾酮浓度为1 μg/mL。-18 ℃避光保存，有效期3个月。

称取5 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL离心管中，向离心管中加入10 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀1 min，于超声波振荡器中常温超声10 min，6000 r/min 离心8 min，取上清液置于旋蒸瓶中，重复操作一次，合并提取液。将提取液于40 ℃水浴中减压蒸发至干。加入2 mL 甲醇、1 mL 水，洗涤瓶壁后混匀，继续加入4 mL正己烷，涡旋混匀后将溶液转移至离心管中，重复操作一次。

将离心管放入离心机于5000 r/min 离心5 min，弃去上层正己烷，将下层甲醇水溶液过亲水-亲脂平衡（HLB）柱(使用前用4 mL 甲醇和4 mL水活化)，20% 甲醇水溶液淋洗后真空抽干，加入4 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于40 ℃水浴下氮吹至干，加入1 mL 流动相充分溶解，经0.22 μm 聚四氟乙烯膜过滤后上机测定。

色谱柱为X-Bridgr C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为甲醇，B 为水；A、B 流动相比例为70∶30，流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30 ℃，检测波长为254 nm。

2 结果与讨论

比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及乙醚四种常用的水产品提取溶剂。四种提取溶剂均能有效地提取水产品中的甲基睾酮。但是乙醚挥发性强，对环境危害较大；甲醇和乙腈易溶于水，水产品基质含有较多水分，在旋蒸过程中带入不易蒸干；乙酸乙酯具有不易挥发、毒性较小、提取效率高的优点。因此本文采用乙酸乙酯作为水产品中甲基睾酮的提取溶剂。

甲基睾酮属蛋白同化激素，脂溶性强，基质效应严重，有效去除杂质是准确定量和实现低检出限的关键。而水产品蛋白含量高，干扰物质较多，必须采用有效的方法去除杂质。本文采用正己烷去脂和固相萃取柱萃取相结合的净化方式，更好地去除杂质干扰，保证目标物的回收率，进一步降低目标物的检出限。本文比较了四种不同的固相萃取柱（C18 柱、HLB 柱、中性氧化铝柱以及MAX 柱)对甲基睾酮的净化效果，其回收率的结果见图1。本实验选择利用亲水亲脂的HLB柱，步骤简单，净化效果好。

图1 不同固相萃取柱的目标物回收率

选择合适的流动相使目标物能较好分离，不妨碍检测器的正常工作在波长范围无吸收并且保护色谱柱，保证合适的柱压。甲基睾酮药物的两种常用的流动相有乙腈- 水和甲醇- 水两种选择，本文比较上述两种流动相，发现甲醇-水溶液效果最好，甲基睾酮的分离效果最好。当流速为1.0 mL/min 时，从90%比例甲醇逐步降低到70%比例甲醇时甲基睾酮的分离度高，峰形好，出峰快。

图2 甲基睾酮标准色谱峰

用甲基睾酮标准溶液配制浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L 的标准工作溶液，取20 μL 进入高效液相色谱仪中。按照其所得峰面积的平均值与对应标准溶液的浓度作标准曲线，可得甲基睾酮色谱峰面积在浓度0.02-1.0 mg/L 范围内呈线性关系，其标准曲线回归方程为Y=73.4X+1.76，相关系数大于0.9994。将6.0 μg/kg 的加标样品平行测定6 次，以10 倍信噪比对应的甲基睾酮浓度确定该方法定量限为6.0 μg/kg。

选用草鱼、中华鳖、对虾三种不同的空白水产品，按照上述“1.3 样品前处理”进行添加回收试验，分别添加6、30、60 μg/kg 三个水平的标准品，每个添加水平设6 个平行，按1.2 节所述条件进行加标回收率实验，可得到回收率为71.5%-89.2%，相对标准偏差为3.24%-8.03%，具体结果见表1。说明能取得良好的回收效果。

表1 回收率和相对标准偏差

3 小结

本文通过对前处理条件和色谱条件进行优化，建立了利用液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的方法。样品采用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱净化。该方法简单、快速，具有很好的适用性和可操作性，谱图无干扰，提高了方法的准确性和重复性。通过方法学验证，该方法可全面、准确地监测水产品中甲基睾酮药物残留，对水产品进行有效监控，为政府加强对水产品违规使用兽药问题的监管提供技术支撑。