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丹参酮IIA 改善长时间异氟烷麻醉介导星形胶质细胞铁死亡

2022-07-06李冰清王靖澔张鹏蔡敏赵广超

中国典型病例大全 2022年17期
关键词:丹参酮

李冰清 王靖澔 张鹏 蔡敏 赵广超

摘要:全身麻醉药物的神经毒性是重要的临床问题。既往研究表明,多种麻醉药物均可引起神经细胞发生铁死亡,从而介导围术期神经认知损伤症状。然而全麻对脑内非神经元类型细胞的铁死亡过程是否存在影响尚未得到阐明,且缺乏有效的干预措施。本研究证实长时间异氟烷麻醉可介导星形胶质细胞铁死亡,应用鼠尾草根提取物丹参酮IIA可有效逆转这一死亡过程,研究为全麻所致围术期脑功能并发症的防治提供证据。

关键词:异氟烷;铁死亡;丹参酮;神经保护

【中图分类号】  R782.05+4【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026(2022)17--01

前言

近年来全身麻醉的安全性已得到显著提高,由麻醉所导致的直接死亡已不足1/25万,然而高危手术患者,如老年人群与发育期儿童,在接受全麻手术后有可能出现认知功能减退、注意力缺陷等脑功能异常症状,并持续至术后远期[1]。因此,探究全麻药物对大脑神经细胞存活的影响仍具有重要意义。

1.方法

1. 比色法测量CCK-8含量检测细胞活性

使用TRIzol裂解细胞,将对照组、异氟烷组及丹参酮IIA处理组细胞以密度1.0×104个/孔接种至96孔板,加入CCK-8检测试剂,并在37 ℃ 、5%CO2培养箱中孵育培养2~4 h,空白组仅加入CCK-8检测试剂,不加入细胞,作为吸光度參考值。采用酶标仪在450 nm处测定各孔细胞吸光度值(A),并计算细胞的存活率,细胞存活率=(A实验组-A空白)/(A对照组-A空白),每组6个复孔,重复4次。

2. Western blot检测细胞中GPX4、4HNE蛋白水平

裂解培养的星形胶质细胞,并进行细胞内总蛋白的提取。用BCA蛋白分析试剂盒检测蛋白浓度,每上样孔20μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,并转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶进行封闭,加入对应一抗,4℃孵育过夜;加入对应二抗孵育1小时,用1×TBST洗膜3次,每次5min。采用ECL化学发光法检测,并计算蛋白条带的灰度值,以目的蛋白条带和内参蛋白条带的灰度值比值反应目的蛋白的含量变化。

3. 丹参酮IIA及Fer-1药物使用

丹参酮IIA(Tanshinone IIA,TSA)在使用前于5%的DMSO溶液中进行溶解。在异氟烷麻醉开始前,向星形胶质细胞培养液中加入50 nM浓度的TSA,并在37 ℃ 、5%CO2培养箱中孵育培养2~4 h。孵育完成后进行异氟烷麻醉处理。在处理后,我们使用铁蛋白抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)来验证铁死亡途径(浓度为10μM)。

4. 统计分析

所有实验在单盲体系下完成。结果以平均值±标准差形式展示。采用参数t检验及单因素方差分析(One-way ANOVA)参数检验评价各生理指标,对比应用Prism 8.0软件统计。p < 0.05被认为差别具有显著性。

2.结果

2. 应用丹参酮IIA(TSA)逆转异氟烷麻醉介导的星形胶质细胞铁死亡

为验证丹参酮IIA对抗异氟烷麻醉所致星形胶质细胞铁死亡的效能,我们开展药理学干预实验。结果表明,异氟烷麻醉前使用TSA提前孵育,可有效逆转麻醉所致的星形胶质细胞LDH释放增多(ISO+Vehicle vs. ISO +TSA,0.45±0.02 vs. 0.41±0.01,p<0.05,n=4,One-way ANOVA)(图1.a),同时显著上调培养体系中CCK-8含量(ISO+Vehicle vs. ISO +TSA,2.53±0.07 vs. 2.73±0.09,p<0.05,n=4,One-way ANOVA),提高星形胶质细胞活性。在此基础上,我们使用细胞ROS定量检测,以及Western Blot方法测量4-羟基壬醛(4-HNE)的表达含量,以评估应用TSA对星形胶质细胞铁死亡所致脂质过氧化进程。结果表明,TSA处理组细胞ROS丰度显著降低(ISO+Vehicle vs. ISO +TSA,2.06±0.71 vs. 1.25±0.17,p<0.05,n=6,One-way ANOVA)(图1.c),同时异氟烷麻醉前使用TSA孵育后,麻醉后的4-HNE表达较对照组显著降低(ISO+Vehicle vs. ISO +TSA,4.99±0.57 vs. 2.57±0.17,p<0.001,n=4,One-way ANOVA)(图1.d)。上述证据表明,预防性使用丹参酮IIA,可有效改善长时间异氟烷麻醉介导的星形胶质细胞铁死亡,达到神经保护的目的。

3.讨论

既往研究证实,异氟烷、七氟醚、氯胺酮等多种麻醉药物,均可通过诱导神经细胞铁死亡导致围术期脑功能损伤[ 2],然而针对这一死亡途径的有效预防措施仍有待开发。丹参酮IIA是从鼠尾草根部分离出来的一种脂溶性的活性成分[3],尽管在既往研究中已被证实可通过调节细胞内氧化还原状态来保护细胞,从而达到心脑等重要器官保护的目的,但其对内皮细胞与肿瘤细胞的铁死亡途径的调节过程具有较大的异质性,在消化道肿瘤细胞中可促进铁死亡以抑制肿瘤增殖,但可抑制血管内皮细胞铁死亡以改善循环功能。

参考文献:

[1]第294期双清论坛”麻醉学前沿与交叉”, 中华麻醉学杂志 [J]. 2021, 41(11): 1.

[2]ZHAO L, GONG H, HUANG H, et al. Participation of Mind Bomb-2 in Sevoflurane Anesthesia Induces Cognitive Impairment in Aged Mice via Modulating Ferroptosis [J]. ACS Chem Neurosci, 2021, 12(13): 2399-408.

[3]ANSARI M A, KHAN F B, SAFDARI H A, et al. Prospective therapeutic potential of Tanshinone IIA: An updated overview [J]. Pharmacol Res, 2021, 164(105364.

基金项目:国家自然科学基金项目(81901080)

作者简介:李冰清(2001-),女,八年制临床专业,主要研究方向:麻醉学

△通讯作者:赵广超(1992-),男,主治医师,讲师,主要研究方向:麻醉学, E-mail: gczhao0518@outllook.com

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