新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

华炯钢，叶伟成，倪 征，陈 柳，朱寅初，云 涛，张 存

（浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021）

鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）分为两种基因型，即Ⅰ型和Ⅱ型[1-2]。基因Ⅰ型为经典鸭呼肠孤病毒（Classical DRV，CDRV），即番鸭呼肠孤病毒（Muscovey duck reovirus，MDRV），主要感染番鸭和半番鸭，引起鸭坏死性肝炎（俗称番鸭“白点病”或“花肝病”），以肝脾等脏器组织出现大量粟状坏死灶为病理特征，该基因型自1997 年以来在我国广东、广西、福建、浙江和江西等省流行[3]。基因Ⅱ型为新型鸭呼肠孤病毒（Novel DRV，NDRV），可引起番鸭、半番鸭、北京鸭和鹅等发病，特征性病变为肝脾出现严重坏死和出血（俗称“出血性坏死性肝炎”），NDRV 最早发现于2000年，此后开始在我国江苏、浙江、福建、广东、河北、山东等省暴发与流行[2,4-5]。目前，NDRV 已成为我国流行的优势基因型[1-2,6]。

NDRV 基因组由10 个节段的双链RNA 构成，全长23 419 bp。病毒粒子由二十面体对称的双层衣壳组成，直径70 nm，无囊膜。根据SDS-PAGE 电泳结果，将NDRV 基因组分为3 个群，分别是：L 组群（L1、L2、L3）、M 组群（M1、M2、M3）和S 组群（S1、S2、S3、S4）[2-3,5-6]。其中S3 节段编码的σB 是NDRV 衣壳的主要组分和外衣壳蛋白，其功能与哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian reovirus，MRV）的σ3蛋白、鸡呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）及CDRV的σB 蛋白类似，均能够诱导宿主机体产生群特异性中和抗体[7-8]。ARV 与CDRV 的σB 蛋白存在保守的群特 异 性 抗 原 表 位[9-10]。NDRV 与CDRV 为DRV 不 同 的基因型，且DRV 与ARV 均属于禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus，ARVs）成员；NDRV σB 蛋白与ARV及CDRV σB 蛋白的氨基酸序列同源性约为60%和70%[2-3,6]。目前NDRV σB 蛋白的抗原表位及其是否存在群特异性抗原表位尚不清楚。因此，本实验利用原核表达的NDRV σB 蛋白作为免疫原，通过免疫小鼠筛选并制备了该蛋白的单克隆抗体（MAb），并对其识别的抗原表位进行鉴定，为进一步建立NDRV 特异性检测方法及研发表位标记疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒株及实验动物骨髓瘤细胞（SP2/0）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）、ARV S1133株均由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存；NDRV ZJ00M 株和CDRV ZJ2000M 株由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室分离鉴定与保存[2,6]；大肠杆菌DH5α 和BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pET-28a-SUMO 载体由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室构建、保存。6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 主要试剂HRP标记的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG4000、次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）、次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HT）均购自Sigma 公司；MAb 亚类鉴定试剂盒购自赛默飞公司；ECL 化学发光检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司；Ni-NTA kit 购自Novagen 公司。

1.3 重组质粒pET-28a-SUMO-σB 的构建、蛋白表达及纯化利用Oligo6.0 软件，以NDRV ZJ00M 株S3 节段全序列（KF154118）编码的σB 基因ORF 为靶区域设计引物：SigB-F： 5'-CGCGGATCCATGGAGGT GCGTGTGCCAAAC-3'（BamH I）/SigB-R：5'-GCACTC GAGTTACCACCTACACTCCAGGAAG-3'（XhoI），扩增片段大小为1 104 bp，引物由Invitrogen 公司合成。提取NDRV ZJ00M 株RNA 并作为模板，采用上述引物经RT-PCR 扩增σB 基因片段，用BamH I/XhoI 分别双酶切目的片段σB 和载体pET-28-SUMO，经T4 DNA 连接酶连接，构建重组质粒pET-28-SUMOσB，并经BamH I 和XhoI 双酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pET-28-SUMO-σB 转化宿主菌BL21，经IPTG 诱导表达，离心，超声破碎，分离上清液和沉淀。通过SDS-PAGE 检测表达情况。利用Ni-NTA 试剂盒对重组σ 蛋白（rσB）纯化后通过SDSPAGE检测其纯度，并利用核酸蛋白仪测定rσB浓度。

1.4 小鼠的免疫选取6 周龄～8 周龄的BALB/c 小鼠，将纯化的rσB 与弗氏完全佐剂等体积混合乳化后，采用颈背部皮下多点注射免疫（100 μg/只）。间隔2 周免疫一次，共免疫3 次。第二次和第三次免疫时用rσB 与等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免7 d 后尾部采血，分离血清，2 倍倍比稀释，利用纯化的rσB 作为包被抗原，通过间接ELISA 方法[11]检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠，于融合前3 d再用rσB（100 μg/只）加强免疫，利用PEG4000 将小鼠脾细胞与SP2/0 细胞按常规方法融合[12]。

1.5 细胞融合及MAb 的制备细胞融合7 d 后，取杂交瘤细胞培养上清液经1.4 中的间接ELISA 方法检测以筛选阳性杂交瘤细胞，以1.4 中获得的NDRV rσB 的小鼠阳性血清为阳性对照，以未融合的SP2/0细胞上清液为阴性对照。采用有限稀释法对检测的阳性杂交瘤细胞进行3 次克隆纯化，直至筛选结果100%为阳性。对筛选出能够稳定分泌MAb 的杂交瘤细胞按常规方法制备腹水[12]，采用亲和层析方法纯化腹水MAb，通过上述间接ELISA 方法检测杂交瘤上清液和纯化的腹水MAb 效价。

1.6 MAb 亚类鉴定利用MAb 亚类鉴定试剂盒鉴定MAb 的亚类。

1.7 MAb 反应原性的western blot 鉴定将NDRV ZJ00M 株以MOI 0.01 感染DF-1 细胞，以不感染病毒的DF-1 细胞作为空白对照。72 h 后收获DF-1细胞，煮沸裂解后离心，取上清液，以制备的MAb（1∶5 000）为一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，通过western blot 检测MAb 与天然表达的σB 蛋白的反应性。

1.8 MAb 交叉反应性的间接免疫荧光试验（IFA）分别将NDRV ZJ00M 株、CDRV ZJ2000M 株和ARV S1133株均以MOI 0.01感染DF-1细胞，培养48 h后固定细胞，分别以制备的MAb（1∶2 000），1.4 中获得的小鼠rσB 阳性血清（1∶100）和未免疫小鼠血清（1∶100）作为一抗，羊抗鼠IgG-FITC（1∶1 000）为二抗，经IFA鉴定本研究制备的MAb 对CDRV、ARV 是否有交叉反应性。

1.9 MAb 抗原表位的肽扫描法鉴定将σB 蛋白截短成长度为15 个氨基酸、相互重叠5 个氨基酸的多肽，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，共37 条（表1），将多肽用DMSO 溶解后，分别以1 μg/孔包被ELISA板，以制备的各MAb（1∶5 000）为一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，经ELISA筛选各MAb的抗原表位，以1.4中制备的rσB高免小鼠血清为一抗作为阳性对照，以未免疫小鼠血清为一抗作为阴性对照。

将37 条σB 蛋白多肽中与各MAb ELISA 检测呈强阳性的多肽继续以2 个氨基酸为步移，从N 端和C 端再分别逐步截短并合成，共合成8 条多肽（表1）。将这8 条多肽分别包被ELISA 板，采用上述ELISA 方法继续筛选各MAb 的抗原表位。

表1 根据σB蛋白氨基酸序列合成的重叠多肽序列Table 1 Overlapping peptides synthesized according to the amino acid sequence of σB protein

1.10 抗原表位的保守性分析从GenBank 选取不同年代、不同地域且具有代表性的NDRV 与CDRV 分离株，以及鹅呼肠孤病毒（GRV）、新型鹅呼肠孤病毒（Novel GRV，NGRV）、ARV 和火鸡呼肠孤病毒（Turkey reovirus，TARV）等ARVs 成员的代表性病毒，对各病毒中的σB 蛋白氨基酸序列进行比对分析，以确定抗原表位的保守性。

2 结 果

2.1σB 蛋白的原核表达、鉴定及纯化结果重组质粒pET-SUMO-σB 经BamH I 和XhoI 双酶切鉴定及测序鉴定结果显示，σB 基因正确插入pET-28a-SUMO 载体中。将鉴定正确的重组质粒pET-SUMO-σB转化BL21（DE3）中，经IPTG 诱导表达后经SDSPAGE 检测结果显示，重组蛋白主要以包涵体的形式表达，分子量约为55 ku，与预期大小相符；经Ni-NTA His 柱纯化后获得了单一目的条带（图1）。表明，rσB 获得了表达，且纯化效果较好。经计算该蛋白纯度约为85%，经核酸蛋白仪测定该蛋白浓度为1 mg/mL。

图1 rσB表达与纯化的SDS-PAGE检测结果Fig.1 Detection results of expression and purification of recombinant σB protein by SDS-PAGE

2.2 McAbs 亚类鉴定及腹水效价的测定结果将小鼠脾细胞与SP2/0 细胞融合后，经间接ELISA 方法筛选，对筛选获得的阳性杂交瘤细胞株经过3 次克隆纯化，最终获得3 株稳定分泌NDRV σB 蛋白MAb的杂交瘤细胞株，其分泌的MAb 分别命名为10-A5、A1-G9 和B7-E5。间接ELISA 检测结果显示，3株杂交瘤细胞上清液中的抗体效价均为1∶1 280，腹水中的MAb 经纯化后效价均为1∶240 000。抗体亚类鉴定结果显示，3 株MAb 均为IgG1，分泌的抗体轻链均为κ。

2.3 MAb 反应原性的western blot 鉴定结果将NDRV 感染DF-1 细胞72 h 后收获细胞，通过western blot 鉴定上述3 株MAb 的反应原性。结果显示，3 个MAb 均在41 ku 处出现特异性条带，而阴性对照DF-1 细胞无该条带（图2）。制备的10-A5、A1-G9 和B7-E5 均能够与NDRV 感染DF-1 细胞的σB 蛋白发生反应，表明3 株MAb 均能够识别NDRV 天然表达的σB 蛋白，反应原性较强。

图2 MAb反应原性的western blot 鉴定Fig.2 Identification of MAbs reactivity by western blot

2.4 MAb 交叉反应性的IFA 鉴定结果分别将NDRV、CDRV 和ARV 感染DF-1 细胞，并设相应的对照，经IFA鉴定MAb的交叉反应性。结果显示：分别以3 株MAb 及小鼠阳性血清为一抗时，感染NDRV的DF-1 细胞均出现了亮绿色荧光；而感染CDRV 和ARV的DF-1细胞均无绿色荧光；而以小鼠阴性血清为一抗时，所有病毒感染的细胞均无绿色荧光（图3）。表明这3 株MAb 的特异性较强，与其他相关病毒均无交叉反应性。

图3 MAb与NDRV、CDRV和ARV交叉反应性的IFA鉴定结果（200×）Fig.3 Identification of cross-reactivity of MAbs with NDRV,CDRV,and ARV by IFA

2.5 MAb 抗原表位的鉴定结果将人工合成的37条多肽分别包被ELISA 板后，再分别以3株MAb为一抗，经间接ELISA 鉴定其识别的抗原表位。结果显示，3株MAb 10-A5、A1-G9和B7-E5 及小鼠σB蛋白阳性血清均与SigB-4多肽呈阳性反应，而与其余的多肽及小鼠阴性血清均呈阴性反应（图4A）。SigB-4多肽的氨基酸序列31LWDIEEFHTPDVIRV45即为MAb的抗原表位。将呈阳性反应的SigB-4 多肽从N 端和C 端分别以2 个氨基酸为步移截短合成的8 条短多肽包被ELISA 板，再 分 别 以10-A5、A1-G9 和B7-E5 为 一抗，进一步经ELISA 鉴定其识别的抗原表位。结果显示，将SigB-4 多肽从N 端截短2 个氨基酸和从C 端截短2 个氨基酸后的短多肽（分别对应SigB-4-1 和SigB-4-5）均与10-A5、A1-G9 和B7-E5 3 呈强阳性反应。阳性对照与阴性对照与上述结果一致（图4B）。表明，上述3 株MAb 识别的最小抗原表位的氨基酸序列均为33DIEEFHTPDVI43。

图4 各肽段（A）及SigB-4各截短肽段（B）经ELISA扫描鉴定MAb识别的抗原表位Fig.4 Epitopes recognized by MAbs were identified by ELISA scaning of overlapping peptides(A)and sigB-4 truncated peptides(B)

2.6 抗原表位的保守性分析参照NCBI 数据库中相关序列，利用BLAST 对已鉴定的线化抗原表位aa31～aa45 的保守性分析结果显示，该抗原表位序列与不同地域和不同宿主来源的NDRV 和NGRV 分离株σB 蛋白对应氨基酸序列的同源性均为100%；而与ARVs 其他成员CDRV、GRV、ARV 和TARV 不同分离株的相对应蛋白氨基酸序列的同源性为53.3%～73.3%（表2，但数值未在该表中展示）。结果表明该抗原表位（aa33～aa43）在不同地域及不同来源的NDRV分离株中保守性很高，而在ARVs其他成员CDRV、GRV、ARV和TARV 中差异较大。

表2 3株MAb抗原表位保守性分析Table 2 Conservation analysis of antigenic epitopes of three MAbs

3 讨 论

σB 是ARV 和DRV 主要的外衣壳蛋白，能够诱导机体产生群特异性中和抗体[8-9]。对σB 蛋白抗原表位的精确定位为解析σB 介导的免疫保护机制，研发多肽表位疫苗及建立特异性检测方法具有重要意义。MAb 是由单一B 细胞克隆产生的免疫球蛋白，具有特异性强、敏感性高、均质性好、效价高等优点，已成为研究抗原的结构与功能、开发诊断试剂和抗原表位多肽疫苗的强有力工具[13-14]。由于NDRV 是水禽DRV新发的基因型，其σB 的MAb 及MAb 的抗原表位未被解析。为此，本研究制备了3 株鼠源抗NDRV σB蛋白的MAb（10-A5、A1-G9 和B7-E5），并对3 株MAb 的抗原表位进行了鉴定。

抗原表位又称抗原决定簇，是引起宿主免疫应答的物质基础。可分为T 细胞抗原表位和B 细胞抗原表位。B 细胞表位是由抗原表面的亲水性氨基酸组成，易接近B 细胞受体和抗体分子并被识别，能够诱导宿主产生体液免疫反应。为了探究NDRV σB 蛋白的B 细胞抗原表位，本研究利用B 细胞杂交瘤技术制备并获得了3 株NDRV σB 蛋白的MAb，且鉴定了各MAb 的抗原表位。常用的抗原B 细胞表位鉴定方法主要有噬菌体展示肽技术、肽扫描技术以及生物信息学方法预测技术等[15]。本研究根据NDRV σB蛋白序列合成37 条长度为15 个氨基酸、且相互重叠5 个氨基酸的多肽，利用肽扫描技术结合ELISA 方法，筛选各MAb 的抗原表位。该方法相较于噬菌体展示肽技术更简便、快速，但其缺点是仅能鉴定出线性抗原表位[16]。

研究发现，ARV、CDRV 和TARV σB 蛋白的保守氨基酸序列主要位于N 端（aa1～aa113）[10,17]。对于ARV σB 蛋白，已鉴定出两个抗原表位：21KTPACW26和32WDTVTFH38，位于σB 蛋白N 端aa21～aa38，且这两个抗原表位为ARV 特异性B 细胞线性表位[10]；而对于CDRV σB 蛋白，也已鉴定出两个抗原表位，即抗原表位A（65TDGVCFPHHK74）和表位B（19YIRAPACWD27），位 于σB 蛋 白N 端aa19～aa74，且 表 位B 是ARV 和CDRV 的群特异性表位，表位A 是CDRV 的特异性表位[17]。本研究鉴定出的NDRV σB 蛋白的最小抗原表位（33DIEEFHTPDVI43）也位于其N 端，但位点不同。对3 株MAb 识别抗原表位的保守性分析表明，该表位在不同基因型DRV（即CDRV 与NDRV）之间的保守性比较低（同源性小于54.5%），仅为NDRV的特异性表位。这一结果与不同基因型DRV 之间仅能与各自基因型的血清高度中和，而与异源血清仅有弱的交叉中和作用的结论一致[18]。因此，本研究制备的3 株MAb（10-A5、A1-G9 和B7-E5）均可作为鉴别检测NDRV 和CDRV 感染的候选抗体。

NDRV 是目前中国流行鸭呼肠孤病毒病的主要基因型，至今还未有NDRV B 细胞抗原表位的相关报道，本研究首次通过制备针对NDRV σB 蛋白的MAb 对其抗原表位进行了鉴定，为NDRV 的型特异性检测方法及其表位标记疫苗的研究奠定了基础。